陳志宣, 龔國利

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

?

常見阿膠偽品的熒光PCR分子檢測(cè)

陳志宣, 龔國利*

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

在普通PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用Real-Time PCR技術(shù)對(duì)阿膠驢源性成分進(jìn)行鑒定.將從樣品阿膠中提取出的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，使用豬、牛、羊、馬、兔、驢的引物和探針進(jìn)行篩查，結(jié)果呈陽性的即為含有此種動(dòng)物源性成分.市購的三種不同品牌的阿膠使用此方法豬、牛、羊、馬、兔均為陰性，驢為陽性結(jié)果.Real-Time PCR技術(shù)具有省時(shí)高效的優(yōu)點(diǎn)，可一次處理批量樣品.

阿膠; 熒光PCR; 檢測(cè)

0 引言

熒光PCR自1995年由美國Applied Biosystems公司推出開始問世，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，而且比普通PCR特異性更強(qiáng)、操作更加方便快捷，并有效地解決了常規(guī)PCR污染及對(duì)操作人員健康隱患的問題.目前,熒光PCR已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用[1].

使用熒光PCR技術(shù)必須提到熒光定量PCR儀的使用.熒光定量PCR儀所用的光源為激光器光源，從而保證了高能穩(wěn)定且無干擾的熒光激發(fā).由一系列的濾鏡、透鏡和一個(gè)雙色鏡組成的光學(xué)系統(tǒng)將激發(fā)熒光聚焦到光譜儀上，而光譜儀以間隔的方式將這些熒光按照波長的不同來分開，由CCD相機(jī)讀取，與熒光定量PCR儀所連接的電腦上安裝的序列檢測(cè)應(yīng)用軟件將從CCD相機(jī)中收集那些熒光信號(hào)[2]，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

熒光定量PCR技術(shù)在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在PCR擴(kuò)增過程中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)[3].探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′端-3′端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.

本實(shí)驗(yàn)選取了市面上常見的三種品牌的阿膠，使用DNAMAN等軟件對(duì)驢物種進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，然后對(duì)樣品阿膠進(jìn)行Real-Time PCR，旨在從分子水平上對(duì)市售阿膠進(jìn)行真?zhèn)舞b定[4,5].

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豬肉、馬肉、羊肉、牛肉、兔肉均購于就近農(nóng)貿(mào)市場.收集市面上所售包括東阿阿膠在內(nèi)的三種品牌的阿膠，產(chǎn)地、采樣地以及數(shù)量見表1所示.以上樣品采集后放置-80 ℃冰箱備用.

表1 采購樣品信息

1.1.2 主要試劑

所使用的試劑為氯化鈉、Tris鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、2-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉、醋酸鉀、氯仿、異戊醇、無水乙醇、十六烷基三甲基溴化銨、PVP、Tris堿、Tris飽和酚，試劑均在天津市紅巖化學(xué)試劑廠購買，以上試劑均為分析純.Gene Expression Master Mix為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，引物和探針在上海捷瑞生物科技有限公司合成.

1.1.3 主要儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用到的儀器：研磨機(jī)(MM-301)，陜西環(huán)宇儀器設(shè)備有限公司；電子天平(TXB622L)，捷久計(jì)量衡器上海有限公司；高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1G)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV5200)，上海元析儀器有限公司；熒光定量PCR儀(ABI7500)，美國ABI公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì)

利用GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的馬科動(dòng)物驢的基因組序列(圖1)，采用DNAMAN 6.0.3.99軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在保守區(qū)用Primer Express 5.0根據(jù)驢的基因組堿基序列的特異性設(shè)計(jì)驢的上下引物[6]和探針，引物和探針均由寶生物(大連)有限公司合成.驢以及其他五種動(dòng)物的引物和探針[7]序列、Tm值與擴(kuò)增片段大小見表2所示.

圖1 驢betaactin基因

表2 引物和探針DNA序列

物種引物和探針序列5'-3'Tm值/℃大小/bp驢正向引物反向引物探針CCATCCACCATATACGCATGATGCCCGCCCCTGACAATGATATTTGACCTACAACGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA56.957.567.4127豬正向引物反向引物探針TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAATTTGCGCATTGTGCGTCACCTATATACCGCCATCTTC57.855.669.2387牛正向引物反向引物探針ATATTTATGATATTTGTATAGGTTGAGTAAATACAAACACACTTTAAAACATCGAGGAGCCTGTTCCGTAATCGAT57.358.465.7263羊正向引物反向引物探針CCCTCCACAAACATAAGGAGCCCACCAATCTAGTTCAAGCACACTACAAAGTATCGC58.556.269.5320馬正向引物反向引物探針TCAAAGATGGTGGAGGAACGGTGCCCAAAAAATCAAAACGTAAATTAAGAAAGAGAGCTTAATT57.658.969.4367兔正向引物反向引物探針TGAAATGCCACAACTTGACACCTGTCATAAGAAGGGCAGATAGGACACCTTGCTAGGCCACACCCACGGG56.358.567.2230

1.2.2 DNA的提取與質(zhì)量鑒定

由于阿膠為深加工品，特別是在其煎煮過程中驢皮的細(xì)胞組織被破壞，DNA部分被分解.所以本實(shí)驗(yàn)選擇DNA得率較高的SDS提取法[8,9].用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，并使用朗波-比爾光吸收定律來計(jì)算樣品DNA濃度[10].

已知A=-lgT=εbc，樣品濃度為c=A/εb，又知ε=0.020，在b=1 cm的情況下，c=A/(0.020×1)=50×A，所以初始樣品濃度為：50×A×稀釋倍數(shù)/1 000(mg/mL).

1.2.3Real-TimePCR擴(kuò)增條件

使用寶生物(大連)有限責(zé)任公司合成的引物、探針、mix為原料進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增[11,12].反應(yīng)體系為25μL，含mix10μL、去離子滅菌水10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探針1μL、模板DNA 2μL,點(diǎn)于同一96孔PCR板上[13,14].此反應(yīng)在7 900 ht熒光定量PCR儀上進(jìn)行，溫度控制程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，45個(gè)循環(huán)95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸2 min[15].在96孔的點(diǎn)樣板上，每一個(gè)品牌的阿膠依次用驢、豬、牛、羊、兔、馬六種引物來擴(kuò)增其序列，由于引物的特異性，擴(kuò)增成功的小孔會(huì)被檢測(cè)到熒光信號(hào)，在顯示器上出現(xiàn)圖譜.為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每種引物做三平行.

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以豬、牛、羊、馬、驢、兔的DNA(100 ng/μL)為模板按照方法1.2.3進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，來檢測(cè)引物和探針的特異性[16].

1.2.5 Real-Time PCR最小檢測(cè)限的測(cè)定

檢測(cè)限是檢測(cè)方法的重要性能指標(biāo)，在使用Real-Time PCR儀時(shí)，為了使得檢測(cè)結(jié)果不受DNA濃度的干擾，需要測(cè)得PCR系統(tǒng)對(duì)阿膠中所提取的DNA最小檢測(cè)濃度.因此，利用濃度梯度分別進(jìn)行點(diǎn)樣出圖，以儀器所能夠檢測(cè)到的最小DNA濃度作為Real-Time PCR儀的最小檢測(cè)限[17].阿膠DNA濃度梯度如表3所示.

表3 阿膠DNA濃度梯度

1.2.6 市售樣品的實(shí)際檢測(cè)

使用在藥房購買的三種品牌的阿膠，分別進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)器檢測(cè)到的熒光信號(hào)所給出的譜圖與Ct值[18]，來分析樣品中是否含有該引物的物種成分.Ct值則可以反映DNA模板的質(zhì)量、濃度與反應(yīng)體系是否協(xié)調(diào).Ct值過高，說明體系中模板濃度太小;Ct值過低，說明模板濃度太高，一般標(biāo)準(zhǔn)Ct值在25左右.

2 結(jié)果與討論

2.1 引物探針特異性

分別以豬、牛、羊、馬、驢、兔的DNA(100 ng/μL)為模板按照方法1.2.3進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，來檢測(cè)引物和探針的特異性.結(jié)果表明，六種動(dòng)物來源的DNA檢測(cè)結(jié)果為陽性(圖2～圖7)，不使用此物種引物的其他物種在45個(gè)循環(huán)內(nèi)均無出現(xiàn)擴(kuò)增(表4)，可見針對(duì)目標(biāo)物種的引物和探針的特異性良好.

表4 引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖2 驢引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖3 豬引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖4 牛引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖6 馬引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

圖7 兔引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)

2.2 最小檢測(cè)限樣品DNA濃度的確定

使用表3的濃度梯度，將樣品稀釋到表中濃度，在260 nm的波長下測(cè)量其OD值，按上述朗波-比爾定律計(jì)算DNA濃度.

表5 DNA濃度梯度

圖8 DNA濃度與Ct值曲線

如表5所示，通過測(cè)得不同稀釋倍數(shù)的DNA溶液在260 nm處的吸光度值，根據(jù)朗波-比爾定律公式c=A/εb計(jì)算得知DNA濃度.圖8為在不同稀釋倍數(shù)下，DNA濃度與Real-TimePCR結(jié)果的Ct值形成的曲線.如圖所示，在Ct值為25時(shí)，對(duì)應(yīng)的是4號(hào)，也就是稀釋15倍，此時(shí)的DNA濃度是PCR最適濃度為12.5mg/mL.Ct值曲線在后期有一個(gè)平臺(tái)期，這個(gè)時(shí)期PCR儀所顯示的數(shù)據(jù)已經(jīng)不能夠說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)的DNA濃度已經(jīng)低于儀器檢測(cè)靈敏度，所對(duì)應(yīng)的DNA濃度為3.8mg/mL,這個(gè)濃度為Real-TimePCR的最小檢測(cè)限.

2.3 市售樣品的實(shí)際檢測(cè)

使用上述方法將東阿、福膠、同仁堂三個(gè)品牌的阿膠進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，每一個(gè)樣品都用豬、牛、羊、馬、驢、兔的引物與探針進(jìn)行反應(yīng).結(jié)果如表6所示.

表6 市售阿膠樣品鑒定結(jié)果

圖9 市售阿膠樣品鑒定結(jié)果

如圖9所示，東阿、福膠以及同仁堂的阿膠驢源性成分均有檢出，而其余物種檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明市售的三種阿膠均不含有豬、牛、羊、馬、兔這五種動(dòng)物源性成分.三種品牌的阿膠，每種做三組平行試驗(yàn)結(jié)果為圖中所示九條陽性熒光曲線，這三種品牌阿膠的平均Ct值分別為：24.72、25.67、25.53，均在25上下波動(dòng)，說明從阿膠中所提取的DNA為驢源性成分，為驢產(chǎn)品無疑.

3 結(jié)束語

阿膠中驢源性成分的鑒定屬于中藥材鑒定范疇，對(duì)于此類問題此前一般采用質(zhì)譜或色譜分析的方法解決，但是這些鑒定方法存在技術(shù)操作復(fù)雜、鑒定準(zhǔn)確性低以及重現(xiàn)性差等問題.目前，較先進(jìn)的物種鑒定方法是采用分子技術(shù)手段.自從1985年Karny Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以來，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用最多、最廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán).

使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶)，不出帶或出帶很弱等.現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件.

在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于驢物種基因片段的分析，應(yīng)用DNAMAN 6.0.3.99、Primer Express 5.0、Oligo 6 等引物設(shè)計(jì)軟件得到一對(duì)能特異性擴(kuò)增驢產(chǎn)品的鑒別引物.而通過本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)5種常見動(dòng)物源性引物復(fù)篩，其結(jié)果皆為陰性擴(kuò)增，更加說明了所設(shè)計(jì)的驢引物的特異性.

本實(shí)驗(yàn)中使用熒光PCR對(duì)市場中可能存在的偽品阿膠的動(dòng)物來源做了調(diào)研，確定了以豬、牛、羊、馬、驢、兔在內(nèi)的六種動(dòng)物作為排查范圍，建立了檢測(cè)體系，通過本實(shí)驗(yàn)的研究，說明基于熒光PCR技術(shù)上的對(duì)阿膠動(dòng)物源性檢測(cè)具有高特異性、高靈敏度，且重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是辨別阿膠真?zhèn)蔚挠行侄?此實(shí)驗(yàn)的開展，也為其他肉類食品的動(dòng)物來源提供了檢測(cè)方案.

[1] 宗 卉，曾少靈，林慶燕，等.飼料中馬、驢源性成分的分子檢測(cè)技術(shù)[J].中國草食動(dòng)物,2005，25(5)：3-6.

[2] 任 亮，朱寶芹，張軼博，等.利用Primer Premier 5.0進(jìn)行PCR引物的研究[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004,25(6)：43-46.

[3] 雷初朝，陳 宏，楊公社，等.中國驢種線粒體DNA D-Loop多態(tài)性研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2005,32(5):481-486.

[4] 孫偉麗.中國四個(gè)地方驢品種mtDNA D-Loop部分序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2002.

[5] Harrison S P，Turrion Gomez J L.Mitochondrial DNA:An important famele contribution to thoroughbred racehorse performance[J].Mitochondrion,2006,6:53-66.

[6] 陳 穎，吳亞君，徐寶梁，等.食品及飼料中馬屬動(dòng)物源性成分的PCR檢測(cè)研究[J].中國生物工程雜志，2004，24(5)：78-83.

[7] 雷明剛，戴麗荷，李鳳娥，等.豬氟烷基因PCR-RFLP檢測(cè)新引物設(shè)計(jì)與條件優(yōu)化[J].養(yǎng)殖與飼料，2005,4(10):52-54.

[8] 侯東軍，楊紅菊，姜艷彬，等.利用PCR技術(shù)鑒定牛羊肉中攙雜豬肉的方法研究[J].寧波農(nóng)業(yè)科技,2009,37(3):41-43.

[9] 曹際娟，盧行安，秦 成，等.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)MBM中牛羊源性成分的方法[J].生物技術(shù)通訊，2002，13(2)：158-160.

[10] 高 博，楊曉農(nóng)，于學(xué)輝，等.家兔GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立[J].中國馴牧獸醫(yī)，2010,37(1)：69-72.

[11] 王全喜，紅 海，芒 來.蒙古馬肌生成抑制基因(MSTN)的克隆及序列分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21(5)：45-49.

[12] 王 沖，譚亞娣，郭愛珍，等.家貓ACE2基因克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2005,76(6):18-21.

[13] 饒 剛，李 明，牛屹東，等.陳舊皮張中DNA提取的新方法[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2001,36(4):53-57.

[14] 黃大鵬，陳建華.全血中DNA的5種不同提取方法比較研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006，27 (6)：96-99.

[15] Calvo J H,Zaragoza P,Osta R.Technical note:A quick and more sensitive method to identify pork in processed and unprocessed food by PCR amplification of a new specific DNA fragment[J].J Anim Sci,2001(79):2 108-2 112.

[16] Soichi T,Eiji M,Kazuhiro M,et al.PCR method of detecting pork in foods for verifying allergen labeling and for identifying hidden pork Ingredients in processed foods[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(7):1 663-1 667.

[17] 潘良文，陳家華，丁 燕，等.進(jìn)口肉骨粉中牛成分檢測(cè)研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2001，17(5)： 23-26.

[18] 劉文義,王莉麗.阿膠補(bǔ)益成分分析方法的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事,2009,28(11):682-684.

PCR fluorescence detection of common adulterants Ejiao

CHEN Zhi-xuan, GONG Guo-li*

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Common PCR reaction system have only one pair of primers,but fluorescent PCR reaction also need to add a fluorescent probe.This study using Real-Time PCR technology to identified donkey donkey-derived ingredients.Extracting the gelatin DNA as a template of PCR system.Use the primers and probes of pig,cattle,sheep,horse,rabbit, donkey for screening, positive results of animal origin shall contain such ingredients.Three different brands of commercially available gelatin using this method,the experimental results is that the pig,cattle,sheep,horse,rabbit were negative,donkey is positive results.Real-Time PCR technique is a method of saving time,and can used in mass detection.

Ejiao; Real-Time PCR; detection

2015-03-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20906058)； 陜西科技大學(xué)學(xué)術(shù)骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目(XSG2010009)

陳志宣(1989-)，女，陜西咸陽人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥學(xué)通訊作者:龔國利(1976-)，男，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn)人，教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵,84838702@qq.com

1000-5811(2015)03-0135-05

R285

A