鄭 君，許彩鳳，王志旺

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅中醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

菟蓉補腎方治療多囊卵巢綜合征的作用機制研究*

鄭 君1，許彩鳳1，王志旺2

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅中醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000)

目的：研究菟蓉補腎方對多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS) 大鼠生殖內(nèi)分泌的影響及機制。方法：取有規(guī)律動情周期的雌性SD大鼠16只作為正常對照組；以來曲唑復制PCOS模型，將造模成功的80只大鼠，按體質(zhì)量隨機分為模型對照組、氯米芬組(5 μg/g )、菟蓉補腎方高(68 g/kg)、中(34 g/kg)、低劑量組(17 g/kg)5組。中藥組給予相應藥物灌胃，其余3組給予等量蒸餾水，1 d 1次，連續(xù)21 d，其中氯米芬組最后5 d給予氯米芬。末次灌胃24 h后，稱量各組大鼠體質(zhì)量；股靜脈采血測卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)；稱取卵巢濕質(zhì)量并記錄，計算臟器指數(shù)；觀察卵巢組織病理學改變，對黃體數(shù)、卵泡數(shù)及其成熟程度進行半定量分析；觀察大鼠合籠后的受孕、產(chǎn)仔情況。結(jié)果：菟蓉補腎方高、中劑量組大鼠的卵巢質(zhì)量及指數(shù)均減小，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。菟蓉補腎3個劑量組大鼠的卵泡成熟度增加，竇狀卵泡與黃體數(shù)量均不同程度增多。與模型對照組對比，菟蓉補腎方各組LH 和T 明顯下降，E2、P和FSH 有不同程度升高。菟蓉補腎方高、中劑量組大鼠受孕數(shù)與產(chǎn)仔數(shù)提高，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：菟蓉補腎方對PCOS大鼠具有治療作用，改善性激素失衡狀態(tài)是其作用機制之一。

補腎活血化痰法/治療運用；多囊卵巢綜合征/藥效學；生殖內(nèi)分泌；動物；大鼠

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是生育期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，以慢性無排卵和高雄激素血癥為特征，表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕、多毛和痤瘡，是最常見的無排卵性不孕的原因[1]。中醫(yī)學無本病病名，相關(guān)內(nèi)容散見于“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“不孕”“癥瘕”等篇章。歷代醫(yī)家對PCOS研究頗多，普遍認為本病的病機是以腎虛為本，痰濕、瘀血為標[2]。筆者根據(jù)補腎活血化痰法組成菟蓉補腎方，臨床治療PCOS患者取得良好療效。本研究以PCOS大鼠體質(zhì)量、血清性激素、卵巢組織病理學及合籠后的受孕、產(chǎn)仔情況為研究指標，探討補腎活血化痰法對PCOS大鼠生殖內(nèi)分泌的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

6周齡SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2004-0006。SPF級實驗室許可證號為SYXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

菟蓉補腎方為課題組臨床多年經(jīng)驗方，以補腎活血化痰法組方，由菟絲子、肉蓯蓉、熟地黃、當歸、丹參、半夏、茯苓、皂角刺、山茱萸、巴戟天等10余種中藥組成，藥材由甘肅中醫(yī)學院中藥房提供；氯米芬片，廣州康和藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號120704；來曲唑片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號12082156。卵泡刺激素(FSH，批號1799168)、黃體生成素(LH，批號176081)、雌二醇(E2，批號175761)、孕酮(P，批號176726)、睪酮(T，批號178782)放免試劑盒均購自天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司。N- 5600PC型METASH 可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；BS1103 型ZMARK酶標儀，美國BioRad產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

取有規(guī)律動情周期的雌性SD大鼠16只作為正常對照組，其余大鼠參照相關(guān)實驗方法[3-4]造模：來曲唑1 μg/g(溶于10 g/L羧甲基纖維素中)，1次/d，連續(xù)21 d。將造模成功的80只大鼠，按體質(zhì)量隨機分模型對照組、氯米芬組(5 μg/g )、菟蓉補腎方高(68 g/kg)、中(34 g/kg)、低劑量組(17 g/kg)5組。中藥組給予相應藥物灌胃，其余3組給予等量蒸餾水，1 d 1次，連續(xù)21 d，其中氯米芬組最后5 d 給予氯米芬。

1.4 檢測指標

末次灌胃24 h后，在每組大鼠中隨機取8只，稱量體質(zhì)量，股靜脈采血測FSH、LH、E2、P、T；斷頸處死，剖腹取卵巢，剝?nèi)ブ車街M織，稱取濕重并記錄，計算臟器指數(shù)；卵巢用100 g/L 甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察其組織病理學改變，對黃體數(shù)、卵泡數(shù)及其成熟程度進行半定量分析[5]。每組另外8只大鼠分成2籠，每籠放入1只雄性種鼠合籠，觀察受孕與分娩情況。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、卵巢及其指數(shù)對比

正常對照組大鼠體質(zhì)量增長適中，卵巢色澤紅潤，體積較小。模型對照組大鼠體質(zhì)量增長迅速，卵巢表面蒼白，體積明顯增大，卵巢質(zhì)量及指數(shù)與正常對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。菟蓉補腎方高、中劑量組大鼠的卵巢質(zhì)量及指數(shù)均減小，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

組 別劑量/(g·kg-1)體質(zhì)量/g卵巢質(zhì)量/mg卵巢指數(shù)/(mg·100-1·g-1)正常對照組—265.6±24.2*131.1±16.7**49.49±5.91**模型對照組—294.5±25.0193.9±28.065.81±7.76氯米芬組5×10-3273.3±26.3136.3±17.7**50.31±8.74**菟蓉補腎方高劑量組68267.0±25.2*140.7±18.7**53.00±7.35**菟蓉補腎方中劑量組34271.6±25.5156.0±19.5**57.60±6.60*菟蓉補腎方低劑量組17284.4±26.5159.3±22.8*56.47±10.10

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠卵巢組織病理學對比

正常對照組大鼠的卵巢可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵巢顆粒細胞呈現(xiàn)多層，一般為8～9 層。模型對照組大鼠的卵巢間質(zhì)細胞增生明顯，見較多早期發(fā)育的小卵泡與閉鎖卵泡，排卵前卵泡少；卵泡囊狀擴張明顯，卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞層數(shù)減少，一般為1～3 層，黃體少并有不完全的黃素化。氯米芬組及菟蓉補腎方3個劑量組大鼠的卵泡成熟度增加，竇狀卵泡數(shù)量與黃體數(shù)量均不同程度增多。見圖1。各組大鼠卵巢的竇狀卵泡與黃體數(shù)量對比見表2。

A.正常對照組； B.模型對照組； C.陽性對照組 D.菟蓉補腎方高劑量組；E.菟蓉補腎方中劑量組；F.菟蓉補腎方低劑量組圖1 各組大鼠卵巢組織病理學對比 (HE，×20)

組 別劑量/(g·kg-1)竇狀卵泡數(shù)量/個竇狀卵泡數(shù)量/卵泡計數(shù)量/%黃體數(shù)量/個正常對照組—4.6±1.5**465.4±1.9**模型對照組—1.4±0.9142.0±0.8氯米芬組5×10-32.9±1.2*293.6±1.3*菟蓉補腎方高劑量組682.5±1.1*253.1±1.0*菟蓉補腎方中劑量組342.3±0.7*232.9±0.8*菟蓉補腎方低劑量組171.9±0.6192.5±0.8

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組大鼠血清性激素水平對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清LH 和T 升高、E2和P降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，菟蓉補腎方各組和氯米芬組LH 和T 明顯下降，E2、P和FSH 有不同程度升高。見表3。

組 別劑量/(g·kg-1)卵泡刺激素/(IU·L-1)黃體生成素/(IU·L-1)雌二醇/(ng·L-1)孕酮/(μg·L-1)睪酮/(μg·L-1)正常對照組—5.04±0.836.05±1.53**30.63±5.97**49.27±9.37**45.80±8.77**模型對照組—4.95±0.7912.91±2.8219.75±3.9034.96±6.08101.16±17.79氯米芬組5×10-35.59±0.957.16±1.81**27.76±5.85**45.63±8.83*61.36±11.55**菟蓉補腎方組高劑量組686.14±1.01*7.24±1.84**26.52±4.74**44.57±7.44*69.65±13.54**菟蓉補腎方組中劑量組345.62±0.898.04±1.88**24.65±4.62*40.97±7.8878.70±15.41*菟蓉補腎方組低劑量組174.53±0.759.82±2.31*21.71±4.0836.58±6.5382.19±16.71*

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組大鼠合籠后受孕數(shù)量與產(chǎn)仔數(shù)量對比

合籠后，正常對照組大鼠全部受孕，氯米芬組7只大鼠受孕，模型對照組1只大鼠受孕，并于合籠24 d后開始分娩。菟蓉補腎方高、中劑量組大鼠受孕數(shù)與產(chǎn)仔數(shù)提高，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

組 別劑量/(g·kg-1)受孕數(shù)量/只產(chǎn)仔數(shù)量/只正常對照組—8**8.5±1.6**模型對照組—10.6±1.8氯米芬組5×10-37*6.4±2.7**菟蓉補腎方組高劑量組686*5.8±3.6**菟蓉補腎方組中劑量組346*5.1±3.2**菟蓉補腎方組低劑量組1743.0±3.3

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

多囊卵巢綜合征病因不明，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性，是引起女性月經(jīng)失調(diào)、導致生育期婦女不孕的重要原因 ，發(fā)病機制尚未明確，臨床檢查呈現(xiàn)卵巢多囊性改變、LH/FSH比值增大等[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療PCOS致不孕癥主要是促排卵，常用氯米芬作為首選藥物，但存在高排卵率、低妊娠率的現(xiàn)象，且有發(fā)生卵巢過激綜合征及黃體缺陷的風險。

歷代醫(yī)家對本病的研究眾多，比較統(tǒng)一的認識是該病病機復雜，涉及腎、肝、脾，兼有痰濕、瘀血，腎—天癸—沖任—胞宮軸失調(diào)。腎主胞胎，腎在月經(jīng)的產(chǎn)生中起主導作用，故自古調(diào)經(jīng)種子從腎論治。腎乃先天之本，元氣之根，主藏精氣，是人體生長、發(fā)育和生殖的根本。腎氣虛則胞脈、胞絡空虛，無力攝精成孕；腎陽虛則寒凝血瘀，阻礙孕卵著床；腎精虧虛則卵子難以發(fā)育成熟而排出。腎氣盛，腎精足，卵子作為生殖之精才能發(fā)育成熟而排出。腎陰是卵子發(fā)育的物質(zhì)基礎，腎陽是其生長的動力。菟蓉補腎方中熟地黃、山藥、山茱萸等藥物促進卵泡發(fā)育。菟絲子、巴戟天、肉蓯蓉等藥物振奮腎陽，促進優(yōu)勢卵泡的形成。腎陽不足、無力推動、痰濕瘀血阻滯、卵泡郁閉等是卵泡成熟但不能排出的原因，處方中加入當歸、川芎、丹參、皂角刺等行氣活血通絡之品，使沖任氣血暢達，重陰轉(zhuǎn)陽，促進卵泡的排出。眾所周知，PCOS的基礎治療方法是運動和控制體質(zhì)量[1]。PCOS血清T升高的表現(xiàn)之一是肥胖，中醫(yī)辨證為痰濕。菟蓉補腎方中運用茯苓、陳皮、半夏等藥物以健脾化痰除濕起到利濕減肥、間接調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用。

菟蓉補腎方是課題組長期臨床實踐總結(jié)出的治療PCOS的有效方劑，具有補腎養(yǎng)血、祛痰除濕、活血化瘀的功效，緊扣PCOS腎虛為本，痰濕、瘀血為標的基本病機。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)菟蓉補腎方治療后，PCOS大鼠的體質(zhì)量增長趨緩，LH與T明顯下降，同時E2、P與FSH有所上升，卵巢質(zhì)量及指數(shù)減小，卵巢多囊性病理改變有所緩解，竇狀卵泡數(shù)與黃體數(shù)增加，受孕數(shù)與產(chǎn)仔數(shù)增多。結(jié)果表明：補腎活血化痰法對PCOS有一定的治療作用，改善性激素失衡狀態(tài)、調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌水平是其作用機制之一。

[1]曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：501.

[2]劉新敏，華強.從現(xiàn)代文獻探討多囊卵巢綜合征的中醫(yī)證候及證候要素分布特點[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(2)：34-36.

[3]Kafali H,Iriadam M,Ozardl I,et al.Letrozole-induced polycystic ovaries in the rat: a new model for cystic ovarian disease[J].Arch Med Res,2004,35(2): 103-108.

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[5]陳芊，孫云松，孫選，等.益腎調(diào)肝Ⅱ號方對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢黃體生成素受體表達的影響[J].中醫(yī)雜志，2011，52(16)：1409-1412.

[6]樂杰.婦產(chǎn)科學[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：315.

(編輯 陶 珠)

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1001-6910(2015)05-0067-04

R711.75

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.05.32

鄭君(1982-)，女(漢族)，河南南陽人，主治醫(yī)師，博士，研究方向：中醫(yī)藥調(diào)節(jié)生殖軸及治療月經(jīng)病。

甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1208RJZA194)

2014-12-15；

2015-02-03