唐 冰，韓 敬，周婭琳

（中國人民解放軍成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650032）

鹽酸氟西汀由美國禮來藥廠研制，于1988年獲美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)作為抗抑郁藥在美國上市。其用于中度及頑固性抑郁癥，尤對伴有坐立不安及運動障礙的抑郁癥療效顯著，為老年抑郁癥首選藥，也適用于長期抗復(fù)發(fā)治療。鹽酸氟西汀口服胃腸道吸收少，健康受試者口服單劑量（40～60mg）6～8 h達平均最高血藥濃度（0.02～0.05mg/L），2～4周后達穩(wěn)態(tài)血藥濃度，血漿蛋白結(jié)合率為94%，廣泛分布體內(nèi)，經(jīng)肝臟代謝為去甲氟西汀，繼續(xù)發(fā)揮藥理效應(yīng)，半衰期為1～3 d，去甲氟西汀半衰期為7～15 d，約80%的代謝物最終經(jīng)尿排出，15%經(jīng)大便排出。本試驗中建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法，測定的人血漿氟西汀含量可靠、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好、操作簡便，旨在為該藥品的藥代動力學(xué)及生物等效性研究提供檢測方法。

1 儀器與試藥

API4000型液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI源，美國ABI公司）；Agilent1100型液相色譜輸液泵系統(tǒng)，包括四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱（美國Agilent公司）；數(shù)據(jù)系統(tǒng)為 Analyst 1.4軟件（美國 ABI公司）；AG-135型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TDL-5型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SB3200型超聲波清洗儀（上海音波聲電科技公司）；ZH-2型混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。鹽酸氟西汀對照品（由云南省藥品檢驗所標(biāo)定，含量為100.2%）；鹽酸氟西汀膠囊（進口藥品注冊證號H20120469，規(guī)格為每粒20 mg；PATHEON FRANCE）；氯硝西泮對照品（中國藥品生物制品檢定所）；空白血漿（云南省中心血站）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher化學(xué)公司）；醋酸氨（色譜純，美國TEDIA公司）；甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)華工研究所）；超純水（Milli-Q純水系統(tǒng)）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件［1-10］

色譜柱：保護柱為 Phenomenex C18柱（3.0mm×4.7mm），分析柱為 Allure C18柱（4.6mm×50mm，5μm）；流動相：0.5%甲酸水溶液（70∶30，V/V）+甲醇∶2mmol/L 醋酸氨；流速：0.5mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為大氣壓化學(xué)電離（ESI）源；噴霧電壓IS為4 500 V；霧化溫度為550℃；霧化氣 NEB（GAS 1）為40 L/min；簾氣 CUR為 20 L /min；碰撞氣 CAD 為 5 L /min，輔助氣 AUX（GAS 2）為40 L/min；檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），用于定量分析的離子反應(yīng)分別為 m/z310.3→m/z148.2（氟西?。琺/z316.1→m/z270.0（內(nèi)標(biāo)，氯硝西泮），碰撞誘導(dǎo)解離（CID）電壓分別為13 V（氟西?。┖?5 V（氯硝西泮）。

2.3 貯備液及工作液配制

氟西汀貯備液：精密稱取鹽酸氟西汀對照品28.0mg（相當(dāng)于25mg氟西?。?，置25mL容量瓶，用甲醇溶解并定容配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的貯備液。

內(nèi)標(biāo)貯備液：精密稱取氯硝西泮對照品25mg，置25mL容量瓶，用甲醇溶解并定容配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的貯備液。

工作液：按檢測濃度要求，精密量取適量濃度的氟西汀貯備液或內(nèi)標(biāo)貯備液，置容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度即可。

2.4 血漿樣本預(yù)處理

于0.1mL血漿中分別加入100μL甲醇溶液及200μL內(nèi)標(biāo)溶液（18.0 ng/mL氯硝西泮的甲醇溶液），渦流混合0.5min，離心（10 000轉(zhuǎn) /分）5min后，取上清液 200μL，置進樣小瓶內(nèi)，進樣10μL分析。

2.5 生物樣品中氟西汀測定

于0.1 mL血漿中分別加入100μL甲醇及200μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦流混合 0.5 min，離心（10 000 轉(zhuǎn) /分）5 min 后，取上清液200μL，置進樣小瓶中，進樣10μL分析。

2.6 方法學(xué)考察

特異性：氟西汀和內(nèi)標(biāo)氯硝西泮一級全掃描質(zhì)譜主要生成質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+，分別為 m/z310和 m/z316。選擇性對準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+進行二級質(zhì)譜分析，將待測物及內(nèi)標(biāo)物生成的主要碎片離子用于定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子。氟西汀和氯硝西泮生成的主要碎片離子分別為 m/z148和 m/z270，結(jié)果見圖1。分別取6份不同來源的空白血漿0.1mL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外（以甲醇代替），其余按2.4項下方法操作，進樣10μL，得圖2A；取一定濃度的氟西汀標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液按2.4項下方法操作，進樣10μL，得圖2B和圖2C，氟西汀和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別約為1.5 min和2.0 min。取受試者給藥后收集的血漿樣品，按2.5項下方法操作，得圖2D。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氟西汀和內(nèi)標(biāo)氯硝西泮的測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限：取標(biāo)準(zhǔn)系列血漿溶液0.1mL，置離心試管中，按2.4項下方法操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以生物樣品中待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（W＝1/C2）進行回歸計算，求得直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟西汀的質(zhì)量濃度線性范圍為0.3～25.0ng/mL；方法的最低定量限為0.3 ng/mL，RSD為1.25%。

圖1 一級質(zhì)譜全掃描質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜全掃描質(zhì)譜圖

精密度和準(zhǔn)確度：取標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液高、中、低3個質(zhì)量濃度（20.0，4.0，0.6 ng/mL）的質(zhì)控樣品（QC）各 0.1mL，按 2.4 項下方法制備，每一質(zhì)量濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算QC樣品的質(zhì)量濃度。本試驗中，氟西?。ㄙ|(zhì)量濃度分別為 0.6，4.0，20.0 ng/mL）的RSD均小于2.7%。采用單因素方差分析法計算分析方法的日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果氟西汀的日內(nèi)精密度的 RSD均小于3.8%，日間精密度的 RSD均小于9.6%。

圖2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖

方法回收率與基質(zhì)效應(yīng)：取標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液高、中、低3個質(zhì)量濃度點（20.0，4.0，0.6 ng /mL）的質(zhì)控樣品（QC），每個質(zhì)量濃度測定6個樣本。以待測物的峰面積與經(jīng)甲醇溶液配制的同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)同倍數(shù)稀釋后直接進樣的峰面積之比計算回收率，并通過回收率考察方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，氟西汀血漿質(zhì)量濃度為 0.6，4.0，20.0 ng/mL時的回收率分別為 98.93%，105.67%和96.73%；內(nèi)標(biāo)氯硝西泮的回收率為96.47%。由此可見，本方法不存在基質(zhì)效應(yīng)。

穩(wěn)定性考察：測定樣品血漿中室溫放置4 h和預(yù)處理后室溫放置4 h和24 h，及血漿中經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)，含藥血漿樣品在-30℃冰箱貯存8 d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，氟西汀在血漿中及處理后流動相溶液中穩(wěn)定。

2.7 藥代動力學(xué)測定［11］

經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選18例健康志愿受試者單次口服鹽酸氟西汀膠囊20 mg。主要藥代動力學(xué)參數(shù)：氟西汀峰濃度（Cmax）為（13.267 ±6.267）ng/mL，達峰時間 （Tmax）為（4.333 ±1.970）h，半衰期（t1/2）為（38.109 ±8.919）h，血藥濃度 -時間曲線下面 積 （AUC0→t）為 （546.722 ±342.207）ng/（mL·h），AUC0→∞為（558.333 ±359.178）ng/（mL·h）。平均血藥濃度 -時間曲線見圖 3。

3 討論

氟西汀在體內(nèi)主要由肝臟細(xì)胞色素P450酶氧化代謝，與CYP2D6等多種代謝酶有關(guān)，且同一劑量的氟西汀在不同個體中血藥濃度相差幾倍至幾十倍，需進行血藥濃度監(jiān)測。目前報道的檢測血漿中氟西汀的方法多為高效液相色譜（HPLC）法，由于氟西汀臨床用藥劑量一般在40 mg以下，血漿中氟西汀含量過低，HPLC法雖可測定但誤差較大［1-4］。

圖3 平均血藥濃度-時間曲線

本研究中建立的檢測血漿中氟西汀的LC-MS/MS方法，最低檢測質(zhì)量濃度為0.3 ng/mL，靈敏度高，且血漿樣品不需要特別處理，直接以甲醇進行提取，大大簡化了檢測過程，節(jié)約了時間，適合大樣本量的藥代動力學(xué)和生物等效性研究。

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