李榮貞，趙 軍，李慶英，蘇文萍，官 靜，趙玉美，蘇甜甜

(1.山東省生物制品研究所，山東 泰安 271000;2.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000)

在破傷風人免疫球蛋白的生產中，對半成品及成品的破傷風抗體效價檢測，通常采用中和實驗法(SNT)［1］。該法耗時長、技術要求高、影響因素多、重復性差。據報道［2～5］，用酶聯免疫法(ELISA)測定破傷風抗體效價，迅速、靈敏度高、重復性好、與SNT法測定的結果密切相關［6］，且操作簡單。本文旨在對比SNT法與ELISA法測定破傷風抗體效價的結果，通過對結果的統計分析［7］，證明ELISA法測定破傷風抗體效價的可行性。

1 材料

標準破傷風毒素(中國生物制品檢定研究院，批號:15#，1L+2 mg·mL－1);人源破傷風免疫球蛋白效價國家標準品(中國生物制品檢定研究院，批號:001，10 IU/支);破傷風抗體酶聯免疫診斷試劑盒(泰安京泰生物技術有限公司，共10批);供試品:破傷風人免疫球蛋白(山東泰邦生物制品有限公司共10批);17～19 g SPF級昆明小鼠(質控中心動物室);352型多功能酶標儀［熱電(上海)儀器有限公司］。

2 方法

2.1 SNT法

2.1.1 破傷風抗毒素標準品的稀釋 先預稀釋至4.0 IU·mL－1，貯存于2～8℃?zhèn)溆?，臨用時用硼酸鹽緩沖鹽水稀釋至0.5 IU·mL－1。

2.1.2 供試品溶液的制備 將供試品稀釋成5個稀釋度，各稀釋度之間間隔約為5%，每mL含抗毒素約0.5 IU。

2.1.3 操作 準確吸取1 mL工作標準抗毒素及不同稀釋度的供試品溶液，分別加入棕色小試管中，每管加入等量的實驗毒素［5個試驗量(L+/10)·mL－1］，混合均勻，加塞，37℃結合1 h。準確注射0.4 mL于小鼠腹部(昆明小鼠，SPF級，17～19 g)，標準品及供試品的每個稀釋度各注射3只，連續(xù)觀察5 d，供試品效價為與對照小鼠同時死亡或出現破傷風神經毒癥狀最重的最高稀釋度判定。

2.2 ELISA法［8，9］以試劑盒中的樣品稀釋液分別稀釋試劑盒攜帶標準品、供試品與國家標準品，并用破傷風人免疫球蛋白(批號:T201201，125 IU·mL－1)做質控樣品。

樣品稀釋倍數的確定:樣品的SNT法所測定的破傷風抗體效價均在120 IU·mL－1以上，試劑盒的線性范圍在0.125～1 IU·mL－1之間，所以將質控品和供試品稀釋至試劑盒的線性范圍之內，最終確定樣品稀釋從1∶120到1∶480之間線性最好。

樣品ELISA法效價的測定和計算:將國家標準品(10 IU/支)稀釋至 1.0、0.5、0.25、0.125 IU·mL－1作為標準系列，供試品稀釋至1∶120到1∶480之間。系列稀釋的樣品分別加到酶標板孔中，每個稀釋度做2個孔。按試劑盒說明書操作完成實驗。以國家標準品的濃度及對應的A450值做雙對數曲線，(R2≥0.98試驗成立)，建立線性回歸方程，將不同稀釋倍數的供試品稀釋液A450值的對數值帶入回歸方程，并根據稀釋倍數計算出供試品破傷風抗體效價。

3 結果

3.1 分別利用SNT法和ELISA法對10批供試品的破傷風抗體效價進行檢測，再用ELISA法對這10批供試品進行檢測時，均帶質控樣品(批號:T201201，破傷風抗體效價:SNT法測得的破傷風抗體效價為125 IU·mL－1)，所測數據如表1所示，對表1數據在Excel中進行分析，可知，ELISA法測得的質控品破傷風抗體效價算術平均數(ˉx)為128 IU·mL－1，標準偏差(SD)為3，相對標準偏差(RSD)為3%。SNT法所測10批供試品破傷風抗體效價算術平均數(ˉx)為126 IU·mL－1，標準偏差(SD)為 5，相對標準偏差(RSD)為4%，ELISA法所測10批供試品破傷風抗體效價算術平均數(ˉx)為130 IU·mL－1，標準偏差(SD)為5，相對標準偏差(RSD)為4%，兩種方法檢測結果的RSD值均小于10%，結果均準確可靠。對表1中數據在Excel中利用統計函數CORREL分析得知:SNT法和ELSIA法檢測10批破傷風人免疫球蛋白樣品的破傷風抗體效價值，相關系數為0.91，說明兩種方法相關性非常高。

3.2 利用不同批號的ELISA試劑盒分別對同一批號的國家標準品(GB)，質控品及供試品進行檢測，檢測結果如表2所示，對表2數據在Excel中進行分析，得知不同批號的ELISA試劑盒測得的國家標準品(批號:001)的破傷風抗體效價回收率均在96%～102%之間，結果穩(wěn)定可靠。不同批號的ELISA試劑盒測得的質控品(批號:T201201)的破傷風抗體效價算數平均數(ˉx)為127 IU·mL－1，標準偏差(SD)為2，相對標準偏差(RSD)為2%;不同批號的ELISA試劑盒測得的同一批供試品(批號:T201303)的破傷風抗體效價算術平均數(ˉx)為124 IV·mL－1，標準偏差(SD)為 4，相對標準偏差(RSD)為4%。由上述數據可知，檢測結果的RSD值均小于10%，檢測結果均準確可靠。說明該實驗所用的ELISA試劑盒穩(wěn)定性和重復性較好，質量可靠，可用于成品及半成品的檢測。

表1 破傷風人免疫球蛋白破傷風抗體效價SNT法與ELISA法檢測結果比對

表2 不同批號的破傷風抗體酶聯免疫診斷試劑盒所測破傷風抗體效價檢測結果

4 討論

表2數據顯示，用試劑盒標準品測得的國家標準品回收率均在96%～102%之間，說明國家標準品與試劑盒所帶標準品結果無顯著性差異，初步說明試劑盒質量符合規(guī)定要求。表1數據顯示SNT法與ELISA法所測結果，無明顯差別，且兩種方法檢測結果的RSD值均小于10%，兩種方法檢測結果均準確可靠。但是，SNT法測抗體效價需要有完善的動物實驗室、大量的小白鼠，而且檢測結果影響因素多，周期長達5 d，操作繁瑣［10］，而ELISA 法迅速、靈敏度高、重復性好、與SNT法測定的結果密切相關，操作簡單。說明ELISA法可用于破傷風人免疫球蛋白中間過程的效價監(jiān)控及作為SNT法的輔助方法。

ELISA法應注意的問題是:①選擇質量穩(wěn)定的試劑盒并嚴格按照說明書規(guī)范操作;②每次更換新批號的試劑盒前應用國家標準品(回收率95%～105%)考核試劑盒的質量;③每次試驗都至少做2個平行，每次實驗都帶質控;④若試劑盒中洗滌液內有鹽析現象，將洗滌液充分振蕩溶解，混勻后再做稀釋;⑤加樣應準確，且在反應孔內混勻，因為抗原包被的是反應孔的表面;⑥在洗滌過程中，拍板的幅度要小，最好甩干，因為抗原與抗體的結合并不牢固，振動幅度太大，會使抗原抗體結合鏈斷裂，引起花板現象。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(三部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄Ⅺ F.

［2］Layton GT.A micro－enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)and radioimmunosorbent technique(RIST)for the detection of immunity to clinical tetanus［J］.Med Lab Scien，1980，37(4):323 －329.

［3］Melville － Smith ME，Seagroatt VA，Watkins JT.A comparison of enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)with the toxin neutralization test in mice as a method for the estimation of tetanus antitoxin in human sera［J］.J Biol Stand，1983，11(2):137 －144.

［4］Cox JC，Premier RR，Finger W，et al.A comparison of enzyme immunoassay and bioassay for the quantitative determination of antibodies to tetanus toxin［J］.J Biol Stand，1983，11(2):123 －128.

［5］Gentili G，Pini C，Collotti C.The determination of the potency of human tetanus immunoglobulins by an enzymelinked immunosorbent assay［J］.J Biol Stand，1984，12(2):167－173.

［6］劉彩云，王淑芳，張振龍，等.應用ELISA與中和試驗測破傷風抗毒素的比較［J］.中國生物制品學雜志，1995，8(4):175 －178.

［7］丁玉江，江昭偉，龐日強，等.一種檢測人破傷風免疫血漿特異性抗體的快速準確方法［J］.中國輸血雜志，2005，18(6):475 －477.

［8］余健，吳笛，周志軍，等.一種輔助SNT測定人特異性免疫球蛋白抗體效價的ELISA方法的建立［J］.微生物學免疫學進展，2007，35(3):31 －34.

［9］朱華松，周志軍，尹斌，等.人破傷風類毒素免疫血漿篩選試驗中兩種抗體檢測方法的比較［J］.微生物學免疫學進展，2006，34(1):39 －42.

［10］李裕惠，郭中平，劉紅.ELISA定量檢測人狂犬病疫苗免疫血漿抗體的工作參比品制備［J］.中國輸血雜志，2003，16(5):329－330.