摘要：利用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)九牛膽中的主要成分進(jìn)行定性定量及方法學(xué)論證。通過(guò)建立九牛膽提取物及四種主要成分的代謝譜，并對(duì)比所建立的抗菌模型，獲得其抗菌模式。

關(guān)鍵詞：中藥；抗菌模式；作用模式

中圖分類號(hào)： R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.20.035

九牛膽常常用于治療急慢性扁桃體炎，菌痢，胃痛，熱嗽失音[1-3]。

本文就九牛膽的化學(xué)成分和抗菌作用展開(kāi)了研究。首先，對(duì)九牛膽進(jìn)行化學(xué)成分分析鑒定，并測(cè)定其主要成分的含量（見(jiàn)表1）。其次，選取金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象并獲得藥物作用后的代謝譜。最后，在對(duì)代謝譜進(jìn)行預(yù)處理后，用主成分分析法對(duì)所獲取的代謝譜進(jìn)行分析，從而獲得不同作用機(jī)理藥物的作用模式分類。

表 1 九種抗生素的作用模式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

島津LCMS-2010 HPLC-MS。

乙醇和甲酸為分析純，甲醇為色譜純，超純水。

所有的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

九牛膽市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 九牛膽化學(xué)成分分析

九牛膽放置于40℃烘箱烘干，研磨，過(guò)篩。精確稱取10克粉碎的九牛膽粉末，加入100毫米，95% 乙醇，加熱到60℃，回流24小時(shí)后，提取液減壓濃縮得浸膏I。浸膏I依次使用正己烷、氯仿和丙酮等有機(jī)溶劑依次萃取并濃縮，獲得極性部分II、III和IV。

1.3粉添加于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基的抗菌藥物的濃度以及藥物的溶劑和稀釋劑

添加于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基的抗菌藥物的濃度以及藥物的溶劑和稀釋劑（表2）。

1.4 胞內(nèi)代謝物提取

采用冷凍法獲取胞內(nèi)代謝物。

1.5 LC/DAD/MS分析

采用LC/DAD/法對(duì)九牛膽化學(xué)成分進(jìn)行分析，采用LC/DAD/MS對(duì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)預(yù)處理以及主成分分析

在本文中，采用矩陣進(jìn)行主成分分析[4-8]，以獲得的不同藥物作用金黃色葡萄球菌代謝圖譜的聚類。

2 結(jié)果與討論

2.1 九牛膽的主要化學(xué)成分

圖1 是九牛膽全藥的 高效液相色譜圖。通過(guò)其與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和紫外光譜，九牛膽中有四種主要化學(xué)成分，分別是掌葉防己堿、防已內(nèi)酯、藥根堿和金果欖甙。

為了探測(cè)九牛膽的主要活性成分，在隨后的代謝組學(xué)分析中，在金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中不僅添加九牛膽的提取物，同時(shí)也添加這四種主要化學(xué)成分。

2.2 九牛膽的抗菌模式

圖2是控制樣本，諾氟沙星和萬(wàn)古霉素培養(yǎng)物的胞內(nèi)代謝物的總離子流譜圖。各譜圖有著非常明顯的差異，說(shuō)明胞內(nèi)代謝物可以用于區(qū)分的不同的加藥培養(yǎng)物。

圖3（a）是所得到的所有樣本的總離子流圖和經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理的質(zhì)荷比加和圖。圖3（b）是所得到的所有樣本經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理的質(zhì)荷比加和圖。

圖4 控制樣本，加九種抗生素，九牛膽提取物I，極性部分II-IV，四種單體的培養(yǎng)物的胞內(nèi)代謝物的色譜圖的主成分分析圖

圖4 是所有代謝譜的主成分分析圖。從圖 4 可知，代表萬(wàn)古霉素的單獨(dú)成類，而且根據(jù)已有研究知道其作用靶點(diǎn)是細(xì)胞壁肽聚糖。兩個(gè)濃度的頭孢噻肟鈉的所有投影點(diǎn)也聚集成群，其作用靶點(diǎn)也是已知的——轉(zhuǎn)肽酶。而四環(huán)素，林可霉素，紅霉素，氯霉素，鏈霉素這幾種藥物的作用靶點(diǎn)在核蛋白體亞單位上，同樣它們不同濃度的點(diǎn)都聚在了一類。

圖4顯示九牛膽粗提物I、利福平和諾氟沙星混合在一起，意味著九牛膽提取物應(yīng)該有著和利福平、諾氟沙星一樣的作用位點(diǎn)——核酸分子（表1）。

同時(shí)，從圖4 可以看出，極性部分III和其主要成分金果欖甙，極性部分II和防已內(nèi)酯的投影點(diǎn)分別聚集在一起。

另外，從圖4 可以看出，極性部分IV 及其主要成分掌葉防己堿和藥根堿與粗提物I 的投影點(diǎn)很接近。根據(jù)這個(gè)結(jié)果可以推測(cè)，九牛膽中并非單一物質(zhì)作用于金黃色葡萄球菌，而是多種生物堿共同的作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

在眾多的生物活性成分中，雖然很多成分都對(duì)金黃色葡萄球菌有著抑制作用，但是對(duì)靶標(biāo)起著主要作用的物質(zhì)應(yīng)該和全藥有著一致的作用模式。在九牛膽中并非單一物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌起抑制作用，而是幾種生物堿協(xié)同作用。

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作者簡(jiǎn)介：余雁，博士，蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，講師，研究方向：應(yīng)用化學(xué)。