摘要：目的 探討微小RNA-146a（miR-146a）在大黃素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。方法 將體外去致熱源培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383分為空白對照組、LPS處理組和大黃素+LPS處理組，細(xì)胞培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測細(xì)胞中miR-146a的表達，Western blot法檢測細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達。結(jié)果 與空白對照組相比較，LPS作用后細(xì)胞中miR-146a、TNF-α和IL-6表達量明顯升高；與LPS處理組相比較，大黃素+LPS處理組中miR-146a表達量顯著上調(diào)，而TNF-α和IL-6表達量顯著下調(diào)。結(jié)論 大黃素可上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞中miR-146a的表達，大黃素可抑制巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達，miR-146a可能參與調(diào)控大黃素抗肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程。

關(guān)鍵詞：大黃素；miR-146a；肺泡巨噬細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

微小RNA（microRNA， miRNAs）是一類長度約21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，miRNA由基因組轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。研究表明，miRNAs參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、組織分化和腫瘤形成等生理過程的調(diào)節(jié)[1]。其中miRNA-146a是當(dāng)前研究熱點之一，miRNA-146a在Toll樣受體/核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）炎癥通路中具有重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而抑制炎癥反應(yīng)[2]，另外在LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)中，miRNA-146a的表達與炎癥因子表達呈負(fù)相關(guān)[3]，表明miRNA-146a可能作為抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新作用靶點。近年來研究表明大黃素對急性胰腺炎誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有一定抑制作用[4]，但在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，miRNA-146a是否在大黃素抑制炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了一定作用尚未見報道，為此，本研究擬探討miRNA-146a在大黃素對LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 胎牛血清、Ham's F-12K培養(yǎng)基和0.25%EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；大黃素（純度>98%）購自美國Sigma公司，大黃素用二甲基亞砜配制成0.2 mmol/L的貯存液，-20℃冰箱保存（二甲基亞砜的終濃度小于0.1%，該濃度對細(xì)胞無明顯影響）；脂多糖（LPS）購自美國RD公司；TNF-α、IL-6和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；Trizol和逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物購自美國Invitrogen公司；Prime Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司。

1.2方法 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383購自中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)在含l5%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham' s F-12K培養(yǎng)液中，置于37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞單層貼壁生長至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

1.3實驗?zāi)Ｐ椭苽浼胺纸M 將處于對數(shù)生長期的NR8383細(xì)胞按1×106/孔接種于6孔板，實驗分四組，每組5個復(fù)孔。①LPS處理組：在培養(yǎng)基中加入濃度為1 mg/L的LPS；②空白對照組：每孔加入等體積的PBS；③大黃素+LPS處理組：在培養(yǎng)基中加入濃度為5 mg/L的大黃素作用30 mins后，再加入濃度為1 mg/L的LPS。細(xì)胞放入培養(yǎng)箱6 h后離心收集細(xì)胞，置于-80℃冰箱。

1.4 Western blot檢測NR8383細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達 裂解細(xì)胞并分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體（1∶2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.5 RT-qPCR檢測NR8383細(xì)胞中miRNA-146a的表達 用Trizol試劑提取總RNA，按說明書操作。總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定260 nm與280 nm處光密度比值（D260/D280）為1.9～2.1，瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA純度。采用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR實時熒光定量試劑盒進行實時定量PCR檢測，反應(yīng)在25 μl體系中進行，反應(yīng)條件：50 ℃下30 min逆轉(zhuǎn)錄，94 ℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作為內(nèi)參，miR-146a的相對表達量采用2-△△Ct計算。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，正態(tài)分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TNF-α和IL-6在NR8383細(xì)胞中的表達變化 Western blot檢測結(jié)果表明，與空白對照組相比較，LPS作用后NR8383細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α和IL-6在大黃素+LPS處理組中的表達較LPS處理組顯著下降，有顯著性差異（P<0.05），見圖1。

圖1 Western blotting檢測TNF-α和IL-6在NR8383細(xì)胞中的表達，

以β-actin為內(nèi)參

2.2 miR-146a在NR8383細(xì)胞中的表達變化 LPS作用6 h后NR8383細(xì)胞中miR-146a的相對表達量為（5.19±1.26），與對照組（1.04±0.28）相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；大黃素+LPS處理組中miR-146a的表達量為（12.84±2.08），與LPS處理組相比較，有顯著性差異（P<0.05）。

3討論

急性肺損傷是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞導(dǎo)致肺通透性增加的急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭，是膿毒癥中最常受累的器官之一。而肺損傷時肺泡巨噬細(xì)胞被激活，不但可吞噬侵入肺臟的炎癥粒子，參與肺臟的防御和免疫，而且還能分泌大量的生物活性物質(zhì)參與中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的遷徙過程，因此在急性肺損傷過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。LPS是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要致病成分，也是膿毒癥主要致病因素，在膿毒血癥過程中，LPS可活化肺泡巨噬細(xì)胞Toll樣受體/核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）炎癥通路，導(dǎo)致大量炎癥因子如TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1釋放，最終引起急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發(fā)生[6-7]。TNF-α作為是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早和最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放，而IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑[8]。在本研究采用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383來建立炎癥反應(yīng)模型，并檢測TNF-α和IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達來判斷模型是否建立成功和炎癥反應(yīng)程度。本研究結(jié)果表明，LPS作用NR8383細(xì)胞后，TNF-α和IL-6蛋白表達顯著上調(diào)，從而成功建立起炎癥反應(yīng)模型，與劉[9]的研究結(jié)果相似。

大黃素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌）是一種蒽醌類物質(zhì)，是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體，千百年來被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中醫(yī)藥。近年來研究表明大黃素?fù)碛卸喾N生物學(xué)功能，如抗菌、抗炎和免疫抑制[10]等。同時有研究表明大黃素對急性胰腺炎誘導(dǎo)的肺損傷有一定保護作用[3]。在本研究觀察到，大黃素預(yù)處理肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383后可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，從而首次表明大黃素對肺泡巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有一定抑制作用。

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，miRNAs可通過特異性識別靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)位點而抑制蛋白翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[11]。近年來研究表明miRNAs在機體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了一定作用，而miR-146a是當(dāng)前研究的熱點之一，miRNA-146a可作用于Toll樣受體/NF-κB炎癥通路中的編碼基因IRAK-1和TRAF-6，對Toll樣受體/NF-κB通路具有重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而抑制炎癥反應(yīng)[2，12]。劉芬[13]等觀察到肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a后可下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α的表達，從而表明miR-146a與肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。在本研究中，筆者觀察到LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383后，miR-146a的表達增加，與文獻報道相符；另外大黃素預(yù)處理NR8383細(xì)胞后可進一步上調(diào)miR-146a在細(xì)胞中的表達，同時大黃素可抑制肺泡巨噬細(xì)胞中炎癥因子的表達，可以推測miR-146a在大黃素抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了一定作用。

綜上所述，本研究成功建立起LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，大黃素作用巨噬細(xì)胞后可抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，并誘導(dǎo)miR-146a在細(xì)胞中的表達，表明大黃素發(fā)揮抗炎作用的機制之一可能是通過抑制巨噬細(xì)胞中miR-146a的表達來實現(xiàn)。

參考文獻：

[1]Yang M， Eyers F， Xiang Y2， et al. Expression Profiling of Differentiating Eosinophils in Bone Marrow Cultures Predicts Functional Links betweenMicroRNAs and Their Target mRNAs[J]. PLoS One， 2014， 13；9（5）：97537.

[2]Kumar S， Keerthana R， Pazhanimuthu A，et al.Overexpression of circulating miRNA-21 and miRNA-146a in plasma samples of breast cancer patients[J]. Indian J Biochem Biophys， 2013，50（3）：210-214.

[3]曾振國，邵強，李勇等.白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞微小RNA-146a表達的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2014，23（01）：30-33.

[4]劉守信，張瑋.大黃素對重癥急性胰腺炎致全身炎癥反應(yīng)綜合征大鼠腹腔巨噬細(xì)胞ICAM-3的體外作用[J].中國藥物與臨床，2012，12（08）：1014-1016.

[5]Wu BQ， Luo JM， Wang YH， et al. Inhibitory effects of simvastatin on staphylococcus aureus lipoteichoic acid-induced inflammation in humanalveolar macrophages[J].Clin Exp Med， 2014， 14（2）：151-160.

[6]Zeng Z， Gong H， Li Y， et al. Upregulation of miR-146a contributes to the suppression of inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury[J]. Exp Lung Res， 2013， 39（7）：275-282.

[7]Oliveira MC Jr， Greiffo FR， Rigonato-Oliveira NC， et al. Low level laser therapy reduces acute lung inflammation in a model of pulmonary and extrapulmonary LPS-induced ARDS[J]. J Photochem Photobiol B， 2014， 5（134）：57-63.

[8]Ramakrishna K， Pugazhendhi S， Kabeerdoss J， et al. Association between heat shock protein 70 gene polymorphisms and clinical outcomes in intensive care unit patients with sepsis[J]. Indian J Crit Care Med，2014，18（4）：205-211.

[9]劉芬，江榕，李勇，等.微小RNA-132在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達變化[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2014，26（02）：80-83.

[10]Shrimali D， Shanmugam MK， Kumar AP， et al. Targeted abrogation of diverse signal transduction cascades by emodin for the treatment of inflammatory disorders and cancer[J]. Cancer Lett， 2013， 1；341（2）：139-149.

[11]Xu X， Wu J， Li S， et al. Downregulation of microRNA-182-5p contributes to renal cell carcinoma proliferation via activating the AKT/FOXO3a signaling pathway[J]. Mol Cancer， 2014， 13（1）：109.

[12]Dong S， Xiong W， Yuan J，et al.MiRNA-146a regulates the maturation and differentiation of vascular smooth muscle cells by targeting NF-κB expression[J]. Mol Med Rep， 2013， 8（2）：407-412.

[13]劉芬，曾振國，聶成，等.轉(zhuǎn)染微小RNA-146a對肺泡巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-α表達的影響[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2013，25（06）：335-338.

編輯/肖慧