摘要：活體動(dòng)物光學(xué)成像是利用生物發(fā)光及熒光技術(shù)在活體動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記通過(guò)光學(xué)成像系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)被標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)分子及細(xì)胞等的生物學(xué)過(guò)程。按發(fā)光模式可分為生物發(fā)光和熒光兩類。相對(duì)于傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方法，具有無(wú)創(chuàng)、可多次重復(fù)、實(shí)時(shí)活體成像、靈敏、安全等優(yōu)勢(shì)，這項(xiàng)技術(shù)在標(biāo)記活體內(nèi)腫瘤活體細(xì)胞示蹤、標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面的應(yīng)用廣泛。

關(guān)鍵詞：活體成像；生物發(fā)光；熒光；應(yīng)用

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動(dòng)物研究時(shí)，常采用的方法是處死老鼠，解剖后通過(guò)肉眼觀察臟器病理變化，再組織切片觀察等，無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)活體內(nèi)生物學(xué)事件的發(fā)生、發(fā)展，而活體動(dòng)物光學(xué)成像（ optical in vivo imaging） 主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）2種技術(shù)在活體動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記，通過(guò)成像系統(tǒng)可以動(dòng)態(tài)或靜態(tài)監(jiān)測(cè)被標(biāo)記分子或細(xì)胞在活體動(dòng)物體等的發(fā)展進(jìn)程，以及觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程[1-3]。生物發(fā)光是通過(guò)熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因（GFP、RFP及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。兩者的主要區(qū)別在于生物發(fā)光是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而熒光則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)出熒光再通過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)，就可以直接觀察到被測(cè)物體內(nèi)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和基因行為。

1原理與分類

活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)是指在活體動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因-熒光素酶基因表達(dá)使其產(chǎn)生的熒光素酶蛋白再與小分子底物熒光素作用，需在氧、Mg2+存在的條件下消耗ATP之后發(fā)生氧化反應(yīng)，這時(shí)將產(chǎn)生的化學(xué)能量轉(zhuǎn)化變?yōu)榭梢?jiàn)光能釋放，最后在體外再利用敏感的檢測(cè)器CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子（promoter），成為某種基因的報(bào)告基因，通過(guò)監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)。

1.1生物發(fā)光技術(shù) 生物發(fā)光熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)發(fā)光，其過(guò)程需要底物螢火蟲(chóng)熒光素酶的參與，通過(guò)氧化其特有底物的過(guò)程中，將會(huì)釋放可見(jiàn)光光子，其波長(zhǎng)廣泛約為560 nm（460～630 nm），甚至包括超過(guò)600 nm的重要的波長(zhǎng)紅光范圍。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)吸收可見(jiàn)光的主要成分是血紅蛋白，能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見(jiàn)光；吸收紅外線主要是水和脂質(zhì)，但均對(duì)波長(zhǎng)為590～800 nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長(zhǎng)范圍在紅光超過(guò)600 nm的區(qū)域即使有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被敏感的CCD檢測(cè)器檢測(cè)到。常用方法是構(gòu)建熒光素酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，并移植到受體靶器官中，觀察時(shí)注入外源熒光素，目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)即可發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過(guò)活體動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)（如IVIS spectrum系統(tǒng)）就可以檢測(cè)生物發(fā)光[4]。生物發(fā)光技術(shù)因?yàn)橛兄^高的靈敏度，最少可以檢測(cè)到小動(dòng)物體內(nèi)102個(gè)細(xì)胞此外，還具有對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)迅速、成像速度快、圖像清晰等優(yōu)點(diǎn)[5]。

1.2熒光成像技術(shù) 與生物發(fā)光不同，熒光發(fā)光不需要底物的參與，但需要外部的激發(fā)光源，利用激發(fā)光使熒光基團(tuán)（如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或者熒光染料）達(dá)到較高的能量水平，然后發(fā)射出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的發(fā)射光[6]。熒光成像技術(shù)的信號(hào)水平取決于發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量及激發(fā)光的強(qiáng)度，光線穿過(guò)的組織對(duì)其有強(qiáng)烈的吸收，而且小動(dòng)物的皮膚、毛發(fā)、軟骨和體內(nèi)的食物等都會(huì)產(chǎn)生熒光，將會(huì)對(duì)目標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生干擾，因此熒光成像技術(shù)的敏感性較生物發(fā)光技術(shù)差，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著目標(biāo)深度的增加而成遞減。但是熒光成像技術(shù)具有標(biāo)記靶點(diǎn)的多樣性、一次可以應(yīng)用不同的熒光基因標(biāo)記不同的細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，因而在進(jìn)行一些分子生物學(xué)以及小分子體內(nèi)代謝研究中得到了廣泛應(yīng)用[7]。

2成像過(guò)程

活體動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)一般由高靈敏度的低溫CCD相機(jī)、成像暗箱和成像軟件組成。一般成像過(guò)程是：小動(dòng)物麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，也可以同時(shí)檢測(cè)多只動(dòng)物，只需要調(diào)整控制平臺(tái)升降到一個(gè)合適的視野，選擇合適的條件，對(duì)于熒光成像，需要選擇合適的濾光片，開(kāi)啟激發(fā)光源，激發(fā)熒光物質(zhì)而發(fā)光，拍攝出背景圖與小動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出的光，將其疊加可以清晰地顯示活體內(nèi)發(fā)光情況，完成圖像采集。最后可以通過(guò)軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[8]。

3優(yōu)勢(shì)

比較目前的活體生物體內(nèi)成像技術(shù)，如超生（ultrasound）、計(jì)算機(jī)斷（Computed Tomography，CT）、核磁共振（Magnetic Tesonance imaging，MRI）、正電子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）、單光子衍射（Single-Photon-Emission Computed Tomography，SPECT）等技術(shù)，活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①無(wú)創(chuàng)性，②操作簡(jiǎn)便，③測(cè)量快，④可多個(gè)動(dòng)物同時(shí)測(cè)量，⑤費(fèi)用低廉等[9]。它可以檢測(cè)基因的表達(dá)，標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行體內(nèi)示蹤，觀察藥物在體內(nèi)的治療效果，使量化變?yōu)榭赡堋?/p>

4應(yīng)用研究

4.1抗癌藥物標(biāo)記 信號(hào)在抗癌藥物研究中，在活體動(dòng)物體內(nèi)運(yùn)用已標(biāo)記抗癌藥物，注射入已接種腫瘤的小鼠體內(nèi)，觀察抗癌藥物在不同治療方式時(shí)運(yùn)用不同劑量觀察不同療程的變化。利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，不僅可以靜態(tài)觀察，也可以通過(guò)在不同時(shí)間段動(dòng)態(tài)觀察癌細(xì)胞在體內(nèi)的變化過(guò)程，從而可以觀察到抗癌瘤藥物的最佳治療方式、用藥劑量、給藥時(shí)間等。

4.2示蹤細(xì)胞標(biāo)記 小動(dòng)物活體成像技術(shù)在示蹤細(xì)胞應(yīng)用方面采用了生物發(fā)光和熒光兩種技術(shù)，生物發(fā)光對(duì)標(biāo)記少量細(xì)胞5000個(gè)/視野。近紅外熒光對(duì)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量>300個(gè)/視野較敏感。在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)示蹤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活狀態(tài)及分布走向進(jìn)行觀察，有報(bào)道可示蹤的細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等[10-11]。

4.3細(xì)菌與病毒標(biāo)記 利用細(xì)菌熒光素酶基因可以分為標(biāo)記革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)記好的革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌感染活體動(dòng)物，從而觀察動(dòng)物體內(nèi)受感染部位的變化，用藥物處理后可以觀察感染部位細(xì)菌數(shù)量的變化及受外界刺激后的反應(yīng)，從而通過(guò)系統(tǒng)研究篩選出藥物最佳劑量、給藥濃度及時(shí)間，還可觀察記錄藥物不同劑量對(duì)活體的毒副作用。

4.4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型標(biāo)記 通過(guò)將靶基因、靶細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記再將轉(zhuǎn)入活體動(dòng)物體內(nèi)，形成所需的各種活體動(dòng)物轉(zhuǎn)基因模型，包括癌癥、免疫缺陷、感染等各種疾病，通過(guò)基因治療，先將基因及其代謝產(chǎn)物高效的、安全的傳遞到體內(nèi)靶細(xì)胞，再利用生物發(fā)光觀察目的基因在活體動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)情況，是持續(xù)的還是抑制的。目前基因治療已經(jīng)是一個(gè)熱門話題，可用于癌癥等多種疾病的綜合治療[12-13]。

4.5藥效評(píng)價(jià) 對(duì)于一些需要化學(xué)方法進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)，比如合成藥物，肽段及納米藥物等，可通過(guò)化學(xué)合成的方法與熒光染料進(jìn)行偶聯(lián)，或者量子點(diǎn)標(biāo)記物質(zhì)，再轉(zhuǎn)入活體動(dòng)物內(nèi)，檢測(cè)熒光的發(fā)光情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活體體內(nèi)藥物的追蹤，觀察藥物在活體體內(nèi)實(shí)時(shí)表達(dá)和藥物對(duì)體內(nèi)的準(zhǔn)確反應(yīng) ，還可用來(lái)評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性 ，為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。目前應(yīng)用較多的是通過(guò)腹腔或尾靜脈注射一些腫瘤靶向藥物，觀察其在活體體內(nèi)對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別及跟蹤藥物在體內(nèi)的分布及代謝情況等[14]。

5前景

活體動(dòng)物熒光成像技術(shù)利用自身優(yōu)勢(shì)在不處死動(dòng)物前提下能夠觀察到活體動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)基因表達(dá)及其在體內(nèi)的變化，將從體外分子生物學(xué)研究擴(kuò)展活體小動(dòng)物體內(nèi)的變化，已經(jīng)被大量的科研人員應(yīng)用到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)甚至臨床的研究領(lǐng)域。本儀器采用高靈敏度的檢測(cè)器，使用成本低廉，操作方便，相信在以后的醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域會(huì)有相當(dāng)長(zhǎng)的應(yīng)用空間。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rosenthal E I，Kullbersh B D，King T， et al. Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts[J].Mol Cancer Ther，2007，6（4）：1231-1238.

[2]Garcia T， Jacksin A，Bachelier R， et al. A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone matastasis[J].Clin Exp Metastasis，2008，25（1）：33-42.

[3]Tavazoie S F，Alarcón C，Oskarsson T，et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature，2008，451（7175）：147-152.

[4]Iyer M， Berenji M，Templeton N S， et al. Noninvasive imaging of cationic lipid- mediated delivery of optical and PET reporter genes in living mice[J]. Mol Ther， 2002，6（4）：555-562.

[5]Walensky L D， Kung A L， Escher I， et al. Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix[J]. Science， 2004，305：1466- 1470.

[6]Maggi A，Ciana P. Reporter mice and drug discovery and development [J]. Nat Rev Drug Discov， 2005，4（3）：249-255.

[7]Chen X Y， Conti P S， Moats R A. In vivo near- infrared fluorescence imaging of integrin alphavbeta3 in brain tumor xenografts[J]. Cancer Res， 2004，64：8009-8014.

[8]朱瑋，秦新裕，張宏偉.活體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)在乳腺癌研究中的應(yīng)用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，38：461-464.

[9]Klerk CP，Overmeer RM，Nieres TM，et al.Validity of bioluminescence m，easurements for noninvasive in vivo imaging of tumor load in small animals[J]. Biotechniques， 2007，43（1 Suppl）：7-13，30.

[10]Gondi C S，Veeravalli K K，Gorantla B， et al. Human umbilical cord blood stem cells show PDGF-D-dependent glioma cell tropism in vitro and in vivo[J]. Neuro Oncol，2010， 12（5） ： 453-465.

[11]Hata N，Shinojima N，Gumin J， et al. Platelet-derived growth factor BB mediates the tropism of human mesenchymal stem cells for malignant gliomas[J]. Neurosurgery，2010，66（1） ： 144-156.

[12]Cheong S J，Lee C M，Kim E M， et al. Evaluation of therapeutic efficacy of a VEGFR2-blocking antibody using sodium-iodide symporter molecular imagine in a tumor xenograft model[J]. Nucl Med Biol，2011，38（1）：93-101.

[13]Yamanaka Y，Ralston A. Early embryonic cell fate dicisions in the mouse[J]. Adv Exp Med Biol，2010（695）：1-13.

[14]Chen Xiaoyuan， et al. In vivo Near2Infrared Fluores2 cence Imaging of Integrinαvβ3 in Brain Tumor Xenografts [J].Cancer Research，2004，（64）：8009-8014.

編輯/肖慧