摘要：目的 評價羅氏Cobas e601全自動免疫分析儀檢測人附睪蛋白4殘留試劑的分析性能，探討回收再利用的可行性。方法 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）系列文件和相關(guān)文獻，對血清人附睪蛋白4（HE4）回收試劑的精密度、準確度、分析測量范圍、生物參考區(qū)間進行評價。結(jié)果 羅氏Cobas e601檢測HE4殘留試劑批內(nèi)、批間精密度符合廠商聲明；準確度結(jié)果相對偏差為0～0.72%；分析測量范圍在35.08～1416.50可接受；生物參考區(qū)間適用。結(jié)論 羅氏Cobas e601電化學(xué)發(fā)光檢測使用同批號HE4回收試劑的主要分析性能符合要求，一定時限內(nèi)可回收利用。

關(guān)鍵詞：殘留試劑；電化學(xué)發(fā)光；人附睪蛋白4

羅氏Cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，具有高靈敏度、高特異性、高親和力、高準確度、線性范圍寬、自動化程度高、無放射性污染、操作簡便快速、試劑保存期長、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，是目前最先進的標記免疫測定技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。試劑為原裝進口，成本較高，每瓶試劑條碼記錄為100人份。經(jīng)日常統(tǒng)計，當(dāng)完成100人次檢測后，試劑盒約有15%～25%的殘留試劑，若有效回收利用，可明顯降低試劑成本。本研究以腫瘤標志物HE4著手，在保證標本檢驗質(zhì)量的前提下，探討腫瘤標記物殘留試劑回收利用的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年6月門診體檢者新鮮血清（樣本無溶血、無黃疸、無脂血），混合后分裝﹣20°C冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 德國Roche公司Cobas 6000全自動生化免疫分析模組中e601全自動免疫檢測模塊。標準品、質(zhì)控品Roche原裝配套。檢測試劑為同批次有效期內(nèi)、開啟10d內(nèi)的原裝殘留試劑拼裝混合而成，3～4盒殘留試劑可拼裝一盒。方法是將三聯(lián)瓶中M瓶：鏈霉親和素包被的順磁性微粒（白蓋）、R1：生物素化的抗HE4單克隆抗體（灰蓋）和R2：非同位金屬三聯(lián)吡啶釕+標記的抗HE4單克隆抗體（黑蓋）充分混勻后分別集中于一個試劑盒的3個對應(yīng)瓶中，組成一盒拼裝試劑。使用前置4℃冰箱冷藏，消泡后裝載上機，可避免試劑屏蔽。

1.3 方法 按照標準操作程序?qū)x器進行常規(guī)保養(yǎng)和維護，拼裝試劑上機使用時須做通用腫瘤標志物質(zhì)控（2個濃度水平），確保質(zhì)控在控后進行標本檢測。

1.3.1 精密度驗證 批內(nèi)精密度試驗：①參考美國臨床和實驗室標準組織（CLSI）EP5-A2]，選取2個水平的質(zhì)控血清（TM1、TM2）作為批內(nèi)和批間精密度的待測標本，用原裝試劑和拼裝試劑分別連續(xù)重復(fù)檢測20次。計算平均值、SD和CV；②批間精密度試驗：選擇TM1、TM2 2個濃度的質(zhì)控品，測定1次/d，用原裝試劑和拼裝試劑分別連續(xù)測定20d，計算平均值、SD和CV。通過實驗得到估計的批內(nèi)標準差（S批內(nèi)）和批間標準差（S批間）。并與廠家聲明的不精密度進行比較。根據(jù)CLIA'88要求，批內(nèi)精密度應(yīng)≤1/4TEa，批間精密度應(yīng)≤1/3TEa。

1.3.2 準確度驗證驗證 參考CLSI EP5-A2文件，先用HE4校準品（Lot：168118濃度分別為：4.1pmol/L、196.0pmol/L）對檢測系統(tǒng)進行校準；再用校準品對原裝試劑和拼裝試劑分別進行檢測，對各自檢測結(jié)果與靶值進行比對，計算檢測值與靶值的相對偏倚，計算公式：Bias=（測定值-靶值）/×靶值%

1.3.3分析測量范圍驗證 參考CLSI EP6-A3文件，分別收集HE4濃度接近廠商聲明的線性范圍下限和上限的低值樣本（L）和高值樣本（H），按L、0.75L+0.25H、0.5L+0.5H、0.25L+0.75H、H混合，配制成系列濃度實驗樣本，用拼裝試劑對每個濃度重復(fù)測量2次。在重復(fù)測量誤差符合實驗要求的條件下，數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件上進行多項式回歸分析，判斷實驗所涉及的濃度范圍內(nèi)是否為線性。當(dāng)實驗數(shù)據(jù)為非線性時，計算線性偏離。若每個濃度點的線性偏離小于線性允許誤差，則實驗所涉及的濃度范圍即為線性范圍。本研究設(shè)定重復(fù)誤差≤5%，線性偏差≤10%為可接受的判斷標準。

1.3.4 生物參考區(qū)間驗證 采集在本院體檢者（血液生化、心電圖和B超檢測均正常）空腹血清，用拼裝試劑按標準操作程序進行樣本檢測，要求20個檢測數(shù)據(jù)只允許10%數(shù)據(jù)在給定的生物參考區(qū)間之外，否則需要進行檢測項目的生物參考區(qū)間建立。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證結(jié)果 原裝試劑和拼裝試劑檢測Roche 2個水平的質(zhì)控血清（TM1、TM2），批內(nèi)精密度與批間精密度檢測結(jié)果均符合Roche公司聲明。實測CV均<5%（見表1、2）。

2.2 準確度驗證結(jié)果 與標準品比較，原裝試劑實驗檢測結(jié)果的相對偏差（SE%）為0～0.61%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受。拼裝試劑檢測結(jié)果相對偏差為0～0.72%，也在允許范圍之內(nèi)（見表3）。

2.3 分析測量范圍驗證結(jié)果 對系列濃度樣本檢測結(jié)果和預(yù)期值進行多項式回歸統(tǒng)計，預(yù)期值為X，實測值為Y，得直線方程Y=bX+a，即Y=1.0085+22.836，相關(guān)系數(shù)為0.9995，>0.975，線性理想。實測線性范圍35.08pmol/L～1416.50 pmol/L；試劑盒線性范圍15pmol/L～1500 pmol/L，符合廠商聲明（見表4）。

2.4 生物參考區(qū)間驗證結(jié)果 Roche公司提供的HE4試劑盒生物參考區(qū)間為0.00pmol/L～104.00 pmol/L ，拼裝試劑檢測20個健康人血清標本濃度范圍在18.24pmol/L～65.15 pmol/L，驗證結(jié)果均在儀器說明的參考區(qū)間內(nèi)，該95%生物參考區(qū)間可以采用。

3 討論

按照《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》（ISO15189）對醫(yī)學(xué)實驗師的認可標準，以及美國頒布的《臨床實驗室修正法案》（ CLIA'88）、衛(wèi)生部《三級綜合醫(yī)院評審標準實施細則》、《醫(yī)學(xué)檢驗科管理規(guī)范》等文件的要求，凡引進和改變的檢測系統(tǒng)用于常規(guī)檢測之前，必須對其主要分析性能進行驗證，提供相關(guān)的方法學(xué)驗證實驗數(shù)據(jù)，證實其能夠達到臨床檢測所要求的標準[2～5]。

本研究顯示，殘留試劑檢測HE4 Roche兩個水平的質(zhì)控血清CV批內(nèi)精密度分別為0.82%、0.50%（未校準）；批間精密度分別為1.16%、0.76%（未校準），符合廠商聲明。且殘留試劑與原裝試劑的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），說明殘留試劑重復(fù)性良好。參考CLSI EP5-A2文件，用HE4校準品對殘留拼裝試劑分別進行準確度驗證，相對偏差（SE%）為0～0.72%，SE%≤1/2CLIA'88允許總誤差（TEa）為可接受，即重復(fù)性良好。對一個檢驗項目而言，其線性范圍起碼應(yīng)該覆蓋本項目的醫(yī)學(xué)決定水平和常見疾病的檢測值，實驗中線性結(jié)果分析表明，相關(guān)系數(shù)>0.975，斜率接近1，截距小，各項重復(fù)測定結(jié)果相關(guān)性好，殘留試劑檢測標本可報告范圍在本實驗的高、低值范圍內(nèi)的線性理想。試驗中各驗證 均在給出的生物參考區(qū)間內(nèi)，符合臨床要求。

在工作中應(yīng)注意到不同批次的HE4檢測試劑，不能混合使用。因為試劑批號不同，試劑所含抗體的濃度及活性有所不同，二維條形碼所包含的參數(shù)信息也不同。并且HE4試劑說明書中指出，未開封試劑可穩(wěn)定到標明的保質(zhì)期；試劑一旦開封，放置于2～8的環(huán)境中有效期為8～12w，試劑放置在e601分析儀上的有效期為6w。這是因為試劑開始使用后，由于溫度變化、水分蒸發(fā)等不利因素，會引起試劑中包被的單克隆抗體活性減低[5]，進而導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差。為保證檢驗結(jié)果的準確性，殘留試劑在妥善保存的情況下應(yīng)在規(guī)定時限內(nèi)盡快回收利用，使用前必須做兩點定標和室內(nèi)質(zhì)控，保證檢驗質(zhì)量。

對殘留拼裝試劑的各項分析性能的評價顯示：殘留試劑檢測HE4的精密度、準確度、分析測量范圍和生物參考區(qū)間均符合相關(guān)實驗要求。說明回收的殘留試劑性能穩(wěn)定，質(zhì)量可靠，同批次的殘留試劑在規(guī)定時限內(nèi)可拼裝再利用，可有效降低檢測成本。

參考文獻：

[1]譚浩.電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)E170的應(yīng)用評價[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，18（3）：527-528.

[2]張葵.定量檢測系統(tǒng)方法學(xué)性能驗證實驗的基本方法[J].臨床檢驗雜志，2009，27（5）：321-323.

[3]U.S.Department of Health and Human Services，Centers for MedicareMedicaid Services.Clinical laboratory improvement amendments of 1988：final rule[S].Fed Register，2003：3704.

[4]張茜，郭健.定量檢測方法極限參數(shù)的評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（8）：949-952.

[5]畢波，呂元.定量檢測方法學(xué)性能驗證的系統(tǒng)設(shè)計[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（2）：143-145.

[6]ISO15189，醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則[S].

編輯/成森