摘要：目的 本文旨在優(yōu)化門(mén)冬胰島素的結(jié)晶制備方法，提高原料藥收率，降低成本，提高門(mén)冬胰島素的穩(wěn)定性，為制劑生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)原料。方法 在室溫下通過(guò)對(duì)有機(jī)酸的種類(lèi)、有機(jī)溶劑的濃度、鹽的濃度以及pH，進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過(guò)顯微鏡圖片分析和超高效液相色譜檢測(cè)，優(yōu)化門(mén)冬胰島素的結(jié)晶制備方法。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸宜選用1.0M的甘氨酸為最佳，同時(shí)采用體積分?jǐn)?shù)15%的乙腈、體積分?jǐn)?shù)為0.2%的苯酚、0.2M氯化鈉溶液以及含 2.0～5.0g/L 重組門(mén)冬胰島素，在初始pH為6.0的條件下加入醋酸鋅組成的結(jié)晶液，經(jīng)放大驗(yàn)證得到單斜針狀晶體，形狀規(guī)則均一，結(jié)晶收率可達(dá)99.0%以上。結(jié)論 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)表明，門(mén)冬胰島素原料藥的結(jié)晶方法符合生產(chǎn)要求，結(jié)晶收率良好，易于工業(yè)化生產(chǎn)，可為制劑提供優(yōu)質(zhì)的原料藥。

關(guān)鍵詞：門(mén)冬胰島素；結(jié)晶方法；回收率

中圖分類(lèi)號(hào)：R977.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：20151474

胰島素都是治療糖尿病最有效的藥物，但普通胰島素存在著作用時(shí)間短、吸收變異大、作用峰值明顯、低血糖發(fā)生率高等諸多問(wèn)題，正日益被胰島素類(lèi)似物所替代[1]。而重組門(mén)冬胰島素作為一種速效胰島素類(lèi)似物，是利用基因工程DNA重組技術(shù)[2，3]將人胰島素B鏈第28位的脯氨酸（Pro）替換為負(fù)電荷的門(mén)冬氨酸（Asp），利用電荷的排斥作用來(lái)阻止胰島素單體或二聚體的自我聚合，使分子間的聚合減少。它不但能很好地模擬人胰島素的分泌模式，控制血糖效果較好，而且由于其作用持續(xù)時(shí)間的縮短，不易與下餐前或者夜間胰島素作用發(fā)生疊加，顯著減少了低血糖的發(fā)生率[4]。

就目前技術(shù)而言，固態(tài)胰島素中的晶體形式無(wú)論從貯藏性能還是后續(xù)制劑配方設(shè)計(jì)等方面都較液態(tài)形式方便。結(jié)晶制備得到的晶體具有均一穩(wěn)定的固體分子形式，凍干時(shí)間短，樣品穩(wěn)定性高，因此它更適合工業(yè)化生產(chǎn)。通過(guò)相關(guān)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)基于人胰島素和胰島素類(lèi)似物的結(jié)晶工藝方法很多[5]，但是制備高質(zhì)量和高產(chǎn)量的重組門(mén)冬胰島素結(jié)晶生產(chǎn)工藝國(guó)內(nèi)外也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本課題主要為制備出高質(zhì)量和高產(chǎn)量的重組門(mén)冬胰島素-鋅結(jié)晶，同時(shí)也可推進(jìn)重組胰島素原料藥結(jié)晶的研究進(jìn)展。

1 材料

重組門(mén)冬胰島素（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司生物研究所，批號(hào)：LB02120516）；甘氨酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸鋅、氫氧化銨（廣東光華化學(xué)廠有限公司）；水飽和酚（北京拜爾迪生物科技公司）；乙酸、氯化鈉（西隴化工股份有限公司）；鹽酸（珠海市華成達(dá)化工有限公司）；乙腈（天津市康科德科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

梅特勒-托利多電子天平；北京佳源興業(yè)科技脫色搖床；天津津騰微孔溶液過(guò)濾器；梅特勒-托利多PH計(jì)；鳳凰光學(xué)顯微鏡（PH100）；Waters-Hclass超高效液相色譜儀。

2 方法和結(jié)果

門(mén)冬胰島素和賴脯胰島素都是單體胰島素類(lèi)似物，結(jié)構(gòu)和作用方式有一定的相似性。重組賴脯胰島素常用的結(jié)晶方法為：在1M乙酸體系下，含有1.8～2.5g/L重組賴脯胰島素、100～300mg鋅、0.15%～0.25%苯酚、pH5.9～6.2使其形成晶體[6]。本實(shí)驗(yàn)參考賴脯胰島素的結(jié)晶方法，通過(guò)單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)優(yōu)化門(mén)冬胰島素的最佳結(jié)晶條件。

2.1有機(jī)酸體系的選擇 制備九批30ml結(jié)晶體系，分別含1.0M乙酸3批、1.0M檸檬酸3批、1.0M甘氨酸3批，將門(mén)冬胰島素制備液蛋白濃度稀釋至2.5g/L，苯酚：體積分?jǐn)?shù)含量為0.2%，將pH用氨水調(diào)至pH6.0，加入乙酸鋅：200mg/L，恒溫20～24℃攪拌10h，然后把溫度調(diào)到2～8℃停止攪拌結(jié)晶10h。通過(guò)顯微鏡圖片分析晶型效果，優(yōu)化出最佳的有機(jī)酸。通過(guò)顯微鏡放大160倍觀察，1.0M乙酸時(shí)為無(wú)定形沉淀，1.0M檸檬酸時(shí)為細(xì)小的無(wú)定形的晶體和沉淀共存，1.0M甘氨酸時(shí)為單斜針狀晶體，均一性相對(duì)較好，而且針狀晶體易碎。故選取1.0M的甘氨酸作為最佳的有機(jī)酸體系。

2.2有機(jī)溶劑選擇 考慮到精純后的門(mén)冬胰島素本身就含有一定量乙腈，避免給原料引入其他雜質(zhì)，故而選擇乙腈作為有機(jī)溶劑。在2.1項(xiàng)下篩選出的有機(jī)酸體系下，加入體積分?jǐn)?shù)含量為10%、15%、20%的乙腈。通過(guò)顯微鏡圖片分析晶型效果，優(yōu)化出合適的乙腈濃度。通過(guò)顯微鏡放大160倍觀察，所有結(jié)晶的均一性都非常好，晶體形狀規(guī)則，但10%乙腈、20%乙腈均沒(méi)有15%乙腈的晶體寬度適合，且采用15%乙腈時(shí)晶體的形狀、大小非常規(guī)則。故選取15%乙腈作為最佳的有機(jī)溶劑。

2.3 鹽的選擇 結(jié)晶液中鹽可以提供過(guò)飽和度從而推進(jìn)結(jié)晶的形成，在2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)已篩選的體系下分別加入的氯化鈉，通過(guò)顯微鏡圖片分析晶型效果，優(yōu)化出合適的氯化鈉濃度。通過(guò)顯微鏡放大64倍觀察，0.1M氯化鈉時(shí)結(jié)晶顆粒型晶體較多，0.3M氯化鈉時(shí)結(jié)晶長(zhǎng)短不一，而0.2M氯化鈉時(shí)結(jié)晶均一，晶體形狀規(guī)則。故選取0.2M氯化鈉作為最佳的工藝條件。

2.4 pH選擇 pH在門(mén)冬胰島素的等電點(diǎn)（pH4.8）附近，溶解度最低，但加入醋酸鋅后會(huì)導(dǎo)致pH的升高，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)得知pH的調(diào)節(jié)最好是在加入鋅離子之前進(jìn)行，鋅離子的加入一般認(rèn)為是結(jié)晶開(kāi)始，如果這時(shí)再去調(diào)節(jié)pH會(huì)影響晶體的形態(tài)，從而影響其均一性。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中除鋅離子以外的各物質(zhì)加完混勻后，再調(diào)節(jié)pH后，再加醋酸鋅。在2.1項(xiàng)～2.3項(xiàng)已篩選出的體系下，pH分別取4.5、6.0、7.5進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，通過(guò)顯微鏡圖片分析以及結(jié)晶收率比較，篩選合適的PH。通過(guò)顯微鏡放大64倍觀察，pH6.0時(shí)結(jié)晶均一，晶體形狀規(guī)則，而pH4.5時(shí)結(jié)晶顆粒細(xì)小，pH7.5時(shí)結(jié)晶寬度、長(zhǎng)短不一。故選取pH6.0作為最佳的工藝條件。

2.5 重組門(mén)冬胰島素結(jié)晶純度和收率的測(cè)定方法 色譜條件：采用Waters-Hclass超高效液相色譜儀，C18反相柱，波長(zhǎng)214nm，流動(dòng)相A，0.2mol/L無(wú)水硫酸鈉緩沖液（NaOH調(diào)pH3.0）：乙腈=90：10，流動(dòng)相B：50%的乙腈，流速為0.21ml/min，柱溫40℃，進(jìn)行梯度洗脫，從1.8min到13.4min再到13.8min，流動(dòng)相B由38%增至45%再到80%并持續(xù)至15.8min。測(cè)定方法：將重組門(mén)冬胰島素結(jié)晶上清樣品進(jìn)行色譜分析，記錄色譜峰圖，以外標(biāo)法計(jì)算表達(dá)產(chǎn)物的回收率。將重組門(mén)冬胰島素結(jié)晶晶體，用0.01mol的鹽酸配成4mg/ml進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜峰圖，以面積歸一法和外標(biāo)法分別計(jì)算表達(dá)產(chǎn)物的純度和含量。

2.6放大實(shí)驗(yàn) 在GMP車(chē)間室溫（22～25℃）量取含量為9.35g/L的門(mén)冬胰島素純化收集液16.0L（門(mén)冬胰島素總質(zhì)量150.5g），純化收集液中乙腈體積分?jǐn)?shù)含量為12%，接下來(lái)依次加入甘氨酸1.61kg，氯化鈉 860g，水飽和苯酚溶液86ml，加水至體積42L。將上述溶液的初始溫度調(diào)到（23±2）℃，用濃氨水調(diào)節(jié) pH 至6.20，攪拌10min，再加入0.355M的醋酸鋅溶液364ml，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至 5.87使最終體積為43L。然后攪拌5h，使形成的晶核穩(wěn)定后，降溫至 （5±2）℃靜置18h。取上清液，HPLC法檢測(cè)其門(mén)冬胰島素殘留，并計(jì)算結(jié)晶回收率；經(jīng)3次水洗后，取門(mén)冬胰島素結(jié)晶，配制成溶液后HPLC法檢測(cè)其門(mén)冬胰島素純度、含量，計(jì)算雜質(zhì)殘留率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：上清液中重組門(mén)冬胰島素的含量已低至0.03mg/ml，結(jié)晶收率為99.0%以上。重組門(mén)冬胰島素結(jié)晶含量為100.2%.純度為99.64%，符合工藝要求。

3 討論

胰島素結(jié)晶技術(shù)，早在上世紀(jì)20年代就已開(kāi)始研究，但一直到80年代才獲得完善，可以大規(guī)?；纳a(chǎn)[7]。重組門(mén)冬胰島素因其B28的突變（相對(duì)于人胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)），導(dǎo)致其結(jié)晶條件較為苛刻[8]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸體系對(duì)結(jié)晶的形成至關(guān)重要，在乙酸以及檸檬酸體系下均無(wú)法形成與甘氨酸體系下一樣的均一穩(wěn)定的固體分子。

通過(guò)我們的結(jié)晶工藝的研究，相比不使用結(jié)晶工藝，直接調(diào)沉凍干后收集產(chǎn)品，不但收率會(huì)有超過(guò)99%的提高，而且凍干時(shí)間也會(huì)進(jìn)一步減少。門(mén)冬胰島素結(jié)晶工藝的開(kāi)發(fā)，具有降低胰島素產(chǎn)品生產(chǎn)的綜合成本，有利于提高國(guó)產(chǎn)胰島素的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的作用。

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