摘要：目的 探索人精子在冷凍前與冷凍保護液HSPM的最佳作用時間。方法 16位健康者的精液裝于16個冷凍瓶，按4個不同時間段（5、15、30、60min）共分四組進行。結(jié)果 作用4個不同時間段后，平均精子活力指數(shù)分別為：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 30min是精子與HSPM的最佳作用時間；對于少精者的精子應(yīng)盡快冷凍。

關(guān)鍵詞：HSPM；精子；冷凍復(fù)蘇；精子活力

冷凍保存已廣泛用于生殖領(lǐng)域臨床，是人類生殖助孕技術(shù)的重要組成部分[1]。利用這項技術(shù)，長期有效的保存生殖細胞，解決了男性不育的許多具體問題；但冷凍損害卻使人們的期望值打了折扣。精子冷凍復(fù)溫后的存活率僅僅為35%～60%，與體細胞冷凍復(fù)溫后的存活率可達90%相比較，遠遠不能令人滿意[2，3]。于是，如何使冷凍保存的精子復(fù)溫后的活力接近新鮮精液的活力，成了廣大輔助生殖技術(shù)研究者潛心研究的課題。本文通過冷凍前精子與冷凍保護液HSPM作用4個不同的時間后觀察精子活力的變化，了解HSPM冷凍保護液對精子活力的影響。

1 資料與方法

1.1精液標(biāo)本采集 隨機選取2013年6月～12月來自隨州市婦幼保健院的健康標(biāo)本16例。供精者年齡22～40歲，告知患者取精前禁欲2～7d，清洗雙手和外生殖器，采用手淫法取精。精液納入標(biāo)準為：精液量≥2ml，精子密度≥70×106ml，精子活率（a+b）≥50%。

1.2試劑與儀器設(shè)備 精子冷凍保護液采用瑞典Nidacon公司生產(chǎn)的HSPM，含甘油、葡萄糖等成分。精液分析儀采用徐州廣科GK-9900A 型，液氮罐為 MVE xc47 /11-10；冰箱為松下BCD-1900WE；水浴箱為美國Lab-Line 生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1待標(biāo)本充分液化后，每份精液標(biāo)本分裝于16個1ml冷凍瓶，按4個不同時間段分別分四組進行：5、15、30、60min。

1.3.2每個冷凍瓶加入1mlHSPM冷凍保護液及0.2ml精液充分混勻，在室溫（20℃～22℃）下放置不同時間，到時計算活力精子數(shù)。

1.4統(tǒng)計結(jié)果處理 所有的實驗數(shù)據(jù)全部輸入微機，使用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 HSPM作用前后及作用不同時間后的精子活力變化 充分液化后的新鮮精液與冷凍保護液HSPM作用4個不同時間段后，精子活力均有所下降，平均精子活力指數(shù)分別為：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119）。與新鮮精子的活力相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其中15min和60min下降非常明顯，但30min后的精子活力又稍微有所回升。見表1。

2.2兩種冷凍方法對精子活力的影響 緩凍法復(fù)溫后的平均精子活力指數(shù)（0.181±0.134），高于速凍法的（0.141±0.105），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。兩種冷凍方法結(jié)果均顯示精子活力隨著冷凍時間的延長而下降。見表2。

3 結(jié)果分析

精子冷凍保存包括被冷凍保護劑孵育、降溫冷凍和超低溫儲存、水浴復(fù)溫等過程[4]。這些物理化學(xué)效應(yīng)直接作用于精子， 使其活力不可避免地受到一些影響。

為了盡量減少精子冷凍/復(fù)溫后的活力損失，Polge首先使用甘油作為冷凍保護劑，目前IVF實驗室采用以甘油為主的復(fù)合型配方[5]。冷凍保護劑的作用機制非常復(fù)雜，保護效應(yīng)主要是與水分子形成氫鍵，改變水的正常晶體結(jié)構(gòu)，縮小了水分子體積，減少了凍結(jié)水的量。

甘油分子量大、滲透性高，能插入精子膜的雙層分子，誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)變化。通過-OH基團與水形成氫鍵，降低或阻止細胞內(nèi)冰晶形成，起到了膜內(nèi)保護劑的作用[6]。但甘油所具有的高滲透性，又很容易造成對精子的損傷。因為甘油能夠干擾ATP合成與利用間的平衡，改變精子的生物能量狀態(tài)，依賴離子的細胞反應(yīng)過程的代謝控制會受到損害，發(fā)生不可逆的細胞損傷。因此，保護液中的甘油濃度是一個很重要的因素，當(dāng)甘油濃度過低時防護效果差；而濃度較高時又具有細胞毒性，影響精子活力[7]。

本文欲研究冷凍保護劑與精子的作用時間對其活力的影響，結(jié)果表明：作用后的精子平均活力指數(shù)均較新鮮精子降低，其中15min和60min下降明顯。原因可能是在作用的最初十幾分鐘內(nèi)，甘油對質(zhì)量不太好的精子具有較明顯的負面影響。作用至30min時，精子活力下降趨勢基本停止，甚至稍有回升，此時細胞的代謝活動與保護液達到了新的平衡。作用至60min時，因為長時間與保護液接觸，甘油的高滲透性使精子膜受損，活力降低。實驗表明HSPM保護液中的成分對精子活力有影響，精子與冷凍保存液的作用時間越長，活力受影響越嚴重。因此對于少精者，精子與HSPM充分混勻后，應(yīng)加快冷存。而對于健康者的精子，30min是最好的作用時間。

復(fù)溫時水流至細胞內(nèi)造會成細胞膜破裂，此時的冰晶再形成又加重了冷凍時對細胞膜的損傷。所以，快速復(fù)溫對冷凍精液的活力影響較小。

4 結(jié)論

新鮮精子與冷凍保護液HSPM作用后，由于甘油的高滲透性，精子其活力均有所下降，作用時間越長，活力下降越明顯。因此，冷凍少精者的精液，應(yīng)盡量縮短與冷凍保護液液的作用時間，將其搖勻后盡快進行冷凍處理。30min是精子細胞代謝活動與滲透作用達到平衡的階段，質(zhì)量好的精子活力達到最佳。對于健康者的精液，應(yīng)讓其與保護液作用30min再進行冷凍處理。

參考文獻：

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[3]Lahar-Baratz S，Koimfan M，Shiloh H. Analyzing a factors affecting the success rate of frozen-thawed embryos[J].J Assist report Gent， 2003， 2008（11）：444-448.

[4]張輝，張偉，朱輝，等. IL-1對冷凍復(fù)溫人精子頂體反應(yīng)的影響[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2002， 36（5）：315-352.

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[7]向祖瓊，胡明廣，曹文雷. 兩種冷凍保護劑對精子冷凍保護的效果比較[J]. 上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2006， 25（3） ：318-319.

編輯/哈濤