摘要：酸沉降及變溫條件下，植物會(huì)對(duì)脅迫產(chǎn)生一定的生理響應(yīng)。通過(guò)人工酸沉降，測(cè)定酸脅迫下白三葉在變溫條件下葉片可溶性蛋白、丙二醛（MDA）及抗氧化酶活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，酸沉降脅迫下，葉片MDA、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物酶（SOD）升高，分別升高0.60%～18.82%、10.34%～24.47%、0.09%～18.11%，而可溶性蛋白含量降低2.85%～24.18%，過(guò)氧化氫酶（CAT）活力變化趨勢(shì)不明顯；在融凍脅迫下，葉片抗氧化酶、可溶性蛋白隨溫度下降先增高后降低，最大值出現(xiàn)在-5 ℃，MDA呈上升趨勢(shì)，pH組、CK組最大值均出現(xiàn)在-15 ℃，分別為4.04、3.97 μmol/L。在凍融脅迫下，POD隨溫度升高而上升，SOD和可溶性蛋白先升高后下降，CAT活力先下降后趨于平穩(wěn)，MDA含量持續(xù)下降。白三葉通過(guò)快速激活抗氧化酶活力和積累丙二醛以抑制膜脂過(guò)氧化在酸沉降和凍融脅迫上的適應(yīng)，是未來(lái)值得推廣的園林綠色植物。

關(guān)鍵詞：白三葉葉片；酸沉降；凍融脅迫；抗氧化酶；MDA

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2083-04

白三葉草（Trifolium repens）屬于豆科車軸草屬，是多年生草本植物。其適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒、耐熱、耐干旱，且分布范圍廣。它是一種優(yōu)良的豆科牧草，被廣泛應(yīng)用于園林綠化和草坪建植，也是一種重要的綠肥植物，在發(fā)展園林綠化及園林生態(tài)建設(shè)上起重要作用[1-3]。

酸雨是指pH小于5.6的雨、雪或其他方式形成的大氣降水[4]。近20年來(lái)，我國(guó)酸性氣體造成的大氣污染不斷加劇。繼北美、歐洲之后，中國(guó)已經(jīng)成為世界第三大酸沉降區(qū)， 且酸雨區(qū)面積呈加速發(fā)展的趨勢(shì)[5]。特別是中國(guó)北方地區(qū)，冬季供暖，加重了酸雨的侵蝕，已經(jīng)對(duì)中國(guó)經(jīng)濟(jì)造成巨大損失[6，7]。同時(shí)，溫度是主要影響白三葉草坪生長(zhǎng)的環(huán)境因子，隨著全球氣溫不正常變化導(dǎo)致的融凍型凍害，對(duì)園林景觀也造成一定的損害[8]。

逆境條件下，植物往往容易產(chǎn)生較多的丙二醛（MDA），能與蛋白結(jié)合形成交聯(lián)物，引起生物體大分子蛋白、核酸變化，從而改變細(xì)胞膜系統(tǒng)，因此通常用MDA評(píng)價(jià)植物質(zhì)膜受損程度的指標(biāo)；同時(shí)在脅迫條件下，植物會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧合自由基，引起膜的過(guò)氧化和傷害，而過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）在清除活性氧自由基和防止膜脂過(guò)氧化維持膜完整性上起重要作用。為此，將通過(guò)酸沉降及凍融脅迫的方法，測(cè)量白三葉葉片可溶性蛋白、MDA、抗氧化酶（SOD、CAT、POD）在此過(guò)程中生理指標(biāo)變化和凍融脅迫后恢復(fù)能力，以期了解白三葉對(duì)溫度、酸沉降適應(yīng)的生態(tài)幅，可為未來(lái)作物抗凍及防治酸沉降對(duì)草坪草的危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 白三葉 供試白三葉品種蘭迪（Landy），由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。于2014年4月初挑選飽滿粒大的種子，采用撒播方式，將種子播撒在吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院室外試驗(yàn)田中（N 43°83′35.3″，E 125°28′75.2″）。試驗(yàn)田土壤有機(jī)質(zhì)含量為32 g/kg，全氮1.012 g/kg，全磷0.428 g/kg，全鉀21.55 g/kg，土壤平均pH 6.9。取表層土壤將白三葉種子覆蓋，避免暴曬，播種初期定時(shí)人工澆水，待長(zhǎng)出幼苗，減少澆水量及次數(shù)。盡量保證植物生長(zhǎng)環(huán)境，如光照，濕度、溫度、土壤組分等相同。

1.1.2 模擬酸沉降溶液 根據(jù)長(zhǎng)春市天然降水pH及離子水平，考慮到天然降水離子成分的復(fù)雜性，選擇自來(lái)水配制模擬酸沉降的原溶液，再用濃硫酸與濃硝酸（SO42-∶NO3-=5∶1）配制pH 4.5模擬酸沉降溶液[9]，進(jìn)行模擬酸沉降淋澆，試驗(yàn)以自來(lái)水作為對(duì)照組（CK）。模擬酸雨pH由pHS-3C型雷磁酸度計(jì)測(cè)定與校對(duì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸沉降試驗(yàn) 將試驗(yàn)田分為2組，分別為pH組、CK組，每組面積大小為10 m×3 m，每組之間有2 m緩沖區(qū)。試驗(yàn)于2014年7月對(duì)pH組進(jìn)行模擬酸沉降淋澆，周期為40-55 d，每8 d噴淋一次，噴淋時(shí)間為17：00～18：00，單次噴淋量相當(dāng)于10 mm降雨量，選用塑料壓力噴壺作為人工模擬降雨器，將配制溶液均勻噴至pH組內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)壺內(nèi)壓力調(diào)節(jié)降雨強(qiáng)度，調(diào)節(jié)噴頭控制酸雨雨滴大小。

1.2.2 人工凍融試驗(yàn) 于2014年9月，在試驗(yàn)田中分別從pH組、CK組中隨機(jī)用撬鏟取長(zhǎng)、寬、深均為0.25 m的白三葉樣品，各6份，標(biāo)記好后將帶有土壤及根系的試驗(yàn)材料從室外采樣，送回實(shí)驗(yàn)室（15 ℃）過(guò)夜，第二天早晨開始融凍-凍融處理。融凍試驗(yàn)處理為每2 h降溫5 ℃，一樣的凍融試驗(yàn)為每2小時(shí)升溫5 ℃，試驗(yàn)的溫度設(shè)計(jì)為5、0、-5、-10、-15、-10、-5、0、5 ℃，每2 h一變溫隨即取樣，每次分別從pH組、CK組隨機(jī)剪取葉片混勻后用錫箔紙包裹放入液氮中固定，將活性保存，隨后放于-80 ℃超低溫冰箱中，用于各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定方法 硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[10]；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[10]；分別采用SOD、POD、CAT試劑盒測(cè)定其活性。每個(gè)指標(biāo)做3組平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸沉降及凍融脅迫對(duì)白三葉葉片可溶性蛋白含量的影響

試驗(yàn)中，酸沉降脅迫處理下的葉片可溶性蛋白含量均比對(duì)照組低，降低了2.85%～24.18%，這可能是由于酸沉降使白三葉草體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成酶活性降低或遭到破壞，導(dǎo)致生理代謝紊亂，然而蛋白質(zhì)溶解酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致分解加快，說(shuō)明酸沉降處理引起植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的降低，這與胡雁春[11]對(duì)白三葉耐酸性研究結(jié)果一致。

在融凍階段，溫度由5 ℃降低到-5 ℃時(shí)，酸雨組和對(duì)照組中葉片可溶性蛋白含量均增加并達(dá)到最高，分別為31.44 mg/g、36.79 mg/g，分別增加了23.05%、33.84%，當(dāng)溫度持續(xù)下降到-15 ℃，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，達(dá)到pH組、CK組最小值，分別為19.43 mg/g、20.74 mg/g。在凍融階段，溫度回升至-5 ℃，葉片可溶性蛋白含量又增加達(dá)到第二個(gè)高峰，分別為29.33 mg/g、30.45 mg/g，在持續(xù)升溫過(guò)程中含量基本保持不變（圖1）。這與Fleck等[12]對(duì)冬小麥葉片穩(wěn)定蛋白質(zhì)積累與其抗凍性研究結(jié)果一致，說(shuō)明抗凍性強(qiáng)的品種能更有效地刺激積累保護(hù)物質(zhì)，低溫脅迫使根系細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量增加，有效緩解細(xì)胞代謝抵抗低溫。Guy[13]也得出過(guò)類似的結(jié)論。

2.2 酸沉降及凍融脅迫對(duì)白三葉葉片丙二醛含量的影響

酸沉降脅迫處理下的丙二醛含量高于對(duì)照組， 增加了0.60%～18.82%。說(shuō)明酸沉降處理引起植物葉片MDA含量的積累，MDA是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，MDA含量越高越不利于植物生長(zhǎng)。這與吳杏春等[14]的試驗(yàn)結(jié)果一致，在酸雨脅迫下，造成MDA的相對(duì)含量升高，加劇膜的損傷。

融凍-凍融脅迫中，酸沉降組與對(duì)照組中MDA活力變化趨勢(shì)相同。融凍階段，溫度從5 ℃降到 -15 ℃，白三葉結(jié)凍，葉片丙二醛含量呈上升趨勢(shì)，pH組、CK組最大值均出現(xiàn)在-15 ℃，分別為4.04 、3.97 μmol/L，相對(duì)5 ℃分別增加了31.08%、53.77%。在凍融階段，白三葉開始解凍，丙二醛含量持續(xù)下降，與最高值相比，pH組、CK組分別下降了36.97%、44.26%（圖2）。這說(shuō)明低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞從而有利于活性氧的產(chǎn)生，活性氧過(guò)剩的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，MDA含量多少代表膜損傷程度的大小，這與范玉貞[15]關(guān)于白三葉抗凍生理機(jī)理研究結(jié)果一致。

2.3 酸沉降及凍融脅迫對(duì)白三葉葉片CAT活力的影響

在酸沉降脅迫處理下的CAT活力與對(duì)照組變化趨勢(shì)不明顯，這可能與在較輕的酸沉降脅迫下，并沒(méi)有引起其抗性變化有關(guān)。CAT存在于過(guò)氧化物體內(nèi)，可以清除自由基，使細(xì)胞膜避免損害，說(shuō)明酸沉降處理并不會(huì)引起植物組織中CAT含量有大幅變化。

在融凍階段，隨溫度的降低，白三葉葉片CAT活力增高，-5 ℃時(shí)pH組、CK組CAT活力均達(dá)到最大值，分別為11.49、11.28 U/mg，相對(duì)于5 ℃分別升高了33.88%、26.31%，而當(dāng)溫度繼續(xù)下降時(shí)，CAT活力明顯下降。在凍融階段，隨溫度的升高，CAT活力先下降后趨于平穩(wěn)（圖3）。這與安瑩等[16]試驗(yàn)結(jié)果一致。可見融凍過(guò)程中-5 ℃時(shí)，對(duì)白三葉是沒(méi)有傷害的，但隨著溫度繼續(xù)降低，CAT活力明顯下降，且在凍融升溫階段，未見活力上升，說(shuō)明低溫產(chǎn)生大量H2O2，而過(guò)量的H2O2無(wú)法消除，致使CAT活力下降，引起膜脂過(guò)氧化對(duì)葉片產(chǎn)生傷害。

2.4 酸沉降及凍融脅迫對(duì)白三葉葉片POD活力的影響

本試驗(yàn)中，酸沉降脅迫處理下POD活力比對(duì)照組高，增加了10.34%～24.47%，說(shuō)明酸沉降處理引起植物組織中POD含量增加。POD是植物細(xì)胞的保護(hù)性酶，它的變化能在一定程度上反映品種的抗酸性大小，活性越高，變化越大，抗酸能力越強(qiáng)[11]。

白三葉葉片POD活力在融凍階段隨溫度下降而增高，在葉片完全凍結(jié)（-5 ℃）時(shí)，pH組、CK組達(dá)到最高分別為81.15、65.19 U/mg，升高了17.84%、12.88%。隨溫度繼續(xù)降低，POD活性也隨之下降，并在-15 ℃達(dá)到最小值分別為60.75、54.86 U/mg，下降了33.59%、18.84%。在凍融階段，隨溫度升高葉片解凍而活性上升，隨后趨于穩(wěn)定（圖4）。Zhou等[17]和Guo等[18]對(duì)高寒山區(qū)的多年生牧草中抗氧化酶活力變化的研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 酸沉降及凍融脅迫對(duì)白三葉葉片SOD活力的影響

在酸沉降脅迫下，白三葉葉片SOD活性高于對(duì)照組，增加了0.09%～18.11%，說(shuō)明在適度酸沉降脅迫下可激發(fā)植物自身抗逆體系，誘導(dǎo)SOD活性增大，減少活性氧對(duì)膜脂的過(guò)氧化作用，這與齊澤民等[19]研究結(jié)果一致，說(shuō)明酸沉降脅迫提高了葉片SOD活性。

融凍-凍融脅迫試驗(yàn)中，隨溫度下降，葉片SOD活力增高，在-5 ℃達(dá)到最高，pH組、CK組分別達(dá)到135.24、130.65 U/mg，增加37.36%、46.22%。當(dāng)葉片完全結(jié)凍時(shí)（-15 ℃）SOD活力下降，pH組、CK組分別為110.37、110.48 U/mg。凍融階段，當(dāng)溫度回升至-5 ℃時(shí)，pH組SOD活力再次上升，為119.02 U/mg。隨著升溫，白三葉解凍，SOD活力又降低，但值仍較高（圖5）。在融凍和凍融階段，SOD活性均在-5 ℃達(dá)到最高值，這說(shuō)明白三葉葉片SOD在-5 ℃時(shí)反應(yīng)比較敏感。這說(shuō)明逆境脅迫會(huì)促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，損傷膜系統(tǒng)，植物體內(nèi)SOD活性的升高現(xiàn)已被普遍認(rèn)為是植物抵抗低溫逆境的一種生理反應(yīng)[16]。這與張圣平等[20]在低溫脅迫對(duì)野生黃瓜嫁接苗的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

在酸沉降及變溫脅迫下，白三葉葉片中丙二醛含量增加，加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，白三葉通過(guò)快速激活過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶及超氧化物酶的活力，來(lái)防御離子自由基對(duì)細(xì)胞的傷害，從而保護(hù)白三葉對(duì)脅迫的適應(yīng)，使白三葉仍可以繼續(xù)生長(zhǎng)。結(jié)果表明白三葉對(duì)未來(lái)氣候引起的凍融型及酸沉降型傷害有很強(qiáng)的適應(yīng)性，具有草坪綠化價(jià)值，是值得推廣的優(yōu)良園林植物。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 州，彭 燕，蘇星源.不同葉型白三葉抗氧化保護(hù)及滲透調(diào)節(jié)生理對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（2）：257-263.

[2] 羅 鏹.白三葉坪用價(jià)值研究[J].草業(yè)科學(xué)，2003，23（9）：123-125.

[3] 張鶴山，劉 洋，王 鳳，等.18個(gè)三葉草品種耐熱性綜合評(píng)價(jià)[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26（7）：44-49.

[4] 馮宗煒.中國(guó)酸沉降對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響和防治對(duì)策[J].中國(guó)工程科學(xué)，2000，9（2）：5-12.

[5] THORJORN L，ESPEN L，TANG D G，et al.Acid rain in China [J].Environmental Science Technology，2006，40（2）：418-425.

[6] 張林波，曹洪法，沈英娃，等.蘇、浙、皖、閩、湘、鄂、贛7省酸沉降農(nóng)業(yè)危害：農(nóng)業(yè)損失估算[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1997，17（6）：489-491.

[7] 曹洪法，舒儉民，劉燕云，等.酸沉降對(duì)兩廣地區(qū)農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)損失研究[J].環(huán)境科學(xué)研究，1991，4（2）：1-6.

[8] JONES PD，MOBERG A.Hemispheric and large-scale surface air temperature variations： An extensive revision and an update to 2001[J].The Journal of Climate，2003，16：206-223.

[9] 武發(fā)新，藥 明，馮喜媛.吉林省酸雨分布特征分析[J].吉林氣象，2013（1）：29-31.

[10] 王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2010.

[11] 胡雁春.模擬酸雨對(duì)白三葉種子萌發(fā)及幼苗生理指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：85-89.

[12] FLECK R A，DAY J G，CLARKE K J，et al.Elucidation of the metabolic and structural basis for the cryopreservation recalcitrance of Vaucheria sessilis[J].Cryo-Letters，1990，20：271-282.

[13] GUY C L. Freezing tolerance of plants： Current understanding and selected emerging concepts[J]. Canadian Journal of Botany，2003，81：1216-1223.

[14] 吳杏春，林文雄，洪清培，等.模擬酸沉降對(duì)草坪草若干生理指標(biāo)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2014，21（8）：88-92.

[15] 范玉貞.白車軸草對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：231-233.

[16] 安 瑩，陳雅君，趙 偉，等.低溫對(duì)白三葉膜質(zhì)過(guò)氧化及保護(hù)酶活性的影響[J].草原與草坪，2009（3）：8-11.

[17] ZHOU R L，ZHAO H L. Seasonal pattern of antioxidant enzyme system in the roots of perennial forage grasses grown in alpine habitat related to freezing tolerance[J].Physiologia Plantarum，2004，121：399-408.

[18] GUO F X，ZHANG M X，CHEN Y，et al. Relation of several antioxidant enzymes to rapid freezing resistance in suspension cultured cells from alpine Chorispora bungeana[J].Cryobiology，2006，52： 241-250.

[19] 齊澤民，鐘章成，鄧 君，等.模擬酸雨對(duì)杜仲葉膜脂過(guò)氧化及氮代謝的影響[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，26（1）：38-43.

[20] 張圣平，顧興芳，王 燁，等.低溫脅迫對(duì)以野生黃瓜（棘瓜）為砧木的黃瓜嫁接苗生理生化指的響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2005， 25（7）：1428-1432.