摘要：為建立魔芋（Amorphophallus konjac）中黃瓜花葉病毒的有效檢測(cè)方法，采用ELISA、RT-PCR、Real-time PCR檢測(cè)魔芋中黃瓜花葉病毒（CMV）。結(jié)果表明，由于黃瓜花葉病毒在魔芋葉片中帶毒量少且不穩(wěn)定，ELISA酶聯(lián)檢測(cè)法和RT-PCR均不能有效檢測(cè)出黃瓜花葉病毒，只有Real-time PCR方法才能將其檢出。研究結(jié)果為魔芋中黃瓜花葉病毒快速、準(zhǔn)確的分子鑒定提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：魔芋（Amorphophallus konjac）；黃瓜花葉病毒；ELISA；RT-PCR；Real-time PCR

中圖分類號(hào)：S632.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2252-03

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋屬多年生草本植物，含大量葡甘聚糖，已經(jīng)有2 000多年的種植歷史[1]。近年來(lái)，隨著葡甘聚糖產(chǎn)品開發(fā)的深入，魔芋產(chǎn)品在食品、化工及保健品市場(chǎng)上的需求逐年擴(kuò)大。但是，魔芋因常年無(wú)性繁殖，病毒積累，種性退化，豐產(chǎn)性和品質(zhì)無(wú)法保證，這一問(wèn)題嚴(yán)重制約了魔芋種植業(yè)乃至整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，在世界范圍內(nèi)均有分布。其寄主范圍廣泛，可侵染52科174屬的775種植物[3]。在黃瓜花葉病毒侵染的葉片上，特別是嫩葉，出現(xiàn)黃綠相間的花葉狀條紋或退綠的梭狀斑，葉緣有輕微卷曲[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CMV外殼蛋白（Coat protein，CP）與病毒粒子組裝和蚜蟲傳播相關(guān)[5，6]。迄今為止，對(duì)CMV尚未形成一套安全、高效、穩(wěn)定的病毒防控技術(shù)，因此有必要對(duì)此進(jìn)行研究。目前，用于檢測(cè)CMV的方法主要有ELISA、電鏡和PCR技術(shù)[7-9]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與常規(guī)PCR相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用范圍廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定等[10]。目前，關(guān)于魔芋病毒病的研究較少，尤其是關(guān)于魔芋中黃瓜花葉病毒檢測(cè)的研究還是空白。因此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合植物病毒檢測(cè)特點(diǎn)，建立了黃瓜花葉病毒的Real-time PCR檢測(cè)方法，并將其與ELISA和RT-PCR法進(jìn)行了比較，以期為魔芋病毒的快速診斷提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜花葉病毒從攜帶黃瓜花葉病毒的辣椒葉片上提取。接種材料為組培得到的清江花魔芋（Amorphophallus konjac cv. qingjiang）脫毒植株。

1.2 試劑與儀器

試劑：植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖溶液、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（普洛麥格生物技術(shù)有限公司），dNTPs、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase、DL 2 000 Marker（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），6×Loading Buffer（寶生物工程有限公司），CMV ELISA 試劑盒（北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司）， THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 2.0（東洋紡生物科技有限公司）。引物由英駿生物有限公司合成，序列測(cè)定由上海桑尼生物科技有限公司完成。

儀器：SIGMA 2-16K 型高速離心機(jī)，Elx800型酶標(biāo)測(cè)定儀，ABI Step One熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 病毒的接種 將帶病毒的新鮮辣椒葉片（約0.5 g）剪碎后在接種緩沖液（5 mL PBST，0.1 g PVP-40，0.005 g BSA，0.022 5 g 銅試劑）中研磨，研磨碎后用小塊紗布過(guò)濾到1.5 mL EP管中，插入冰水中備用。取干凈的鋼絲球沾取帶病汁液在健康魔芋的葉片上摩擦，接種后用去離子水沖洗葉面，去除緩沖液對(duì)葉片代謝的影響，7 d后觀察到接種的魔芋植株出現(xiàn)斑葉（圖1）和卷葉（圖2）這兩種典型的黃瓜花葉病毒感染的癥狀，說(shuō)明黃瓜花葉病毒通過(guò)人工接種成功感染了健康的魔芋植株。

1.3.2 DAS-ELISA檢測(cè) 稱取0.3 g的帶黃瓜花葉病毒的魔芋葉片，加入3 mL PBS（pH 7.4），用手工或勻漿器將樣本研磨充分，離心20 min，收集上清液。分裝后一份待檢測(cè)，其他冷凍備用。參考ELISA試劑盒的方法，在終止反應(yīng)后15 min以內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)405 nm波長(zhǎng)下的OD值。數(shù)據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照平均值≥1.00，陰性對(duì)照平均值≤0.10，臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15，樣品OD值<臨界值者為陰性，樣品OD值≥臨界值者為陽(yáng)性。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè) 利用植物總RNA提取試劑盒提取魔芋葉片總RNA及作為陽(yáng)性對(duì)照的攜帶黃瓜花葉病毒的辣椒葉片總RNA，具體方法依照說(shuō)明書進(jìn)行。依據(jù)文獻(xiàn)[10，11]合成引物進(jìn)行篩選檢測(cè)，最終確定CMV引物序列為5′-CGATAAGAAGCTT

GTTTCGCG-3′、5′-CGGCGTACTTCTCATGTCAC-3′，擴(kuò)增的目的序列片段長(zhǎng)度為230 bp。

反轉(zhuǎn)體系：總反應(yīng)體系25 μL，加入染病魔芋總RNA 1 μg，Oligo dT 15 2 μL（0.5 μg/μL），72 ℃下變性5 min，立即取出置于冰上放置5 min。再依次加入5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，dNTP 2 μL （10 mmol/L），M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL（50 U/μL），加入DEPC處理過(guò)的ddH2O 5 μL。將反應(yīng)混合物于PCR儀中42 ℃，90 min；70 ℃，10 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR體系（25 μL）：cDNA 1.5 μL，引物各1 μL（10 μmol/L），dNTP 0.5 μL （10 mmol/L ），10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 2 μL（25 mmol/L），Taq 酶1 U/μL，ddH2O 15.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：采用常規(guī)PCR，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，36個(gè)循環(huán)；最后再72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物4 μL，溴酚藍(lán)約1 μL，以DL 2 000作為Marker，于瓊脂糖凝膠（凝膠濃度1.0%，TBE 緩沖體系）中電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)在標(biāo)準(zhǔn)紫外光下成像。

1.3.4 Real-time PCR檢測(cè) Real-time PCR所用的引物與RT-PCR的引物相同。反應(yīng)體系為20 μL：已反轉(zhuǎn)的模板cDNA 2 μL、2.0× SYBR Master Mix 10 μL （已加入Rox）、上下游引物各0. 5 μL（ 20 μmol/ L），加去離子水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以攜帶黃瓜花葉病毒的辣椒葉片為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行，反應(yīng)在ABI Step One熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

將PCR產(chǎn)物送到上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，提供產(chǎn)物和引物DF進(jìn)行單向測(cè)序。DNA序列采用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行分析，并在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果

采用CMV ELISA試劑盒檢測(cè)魔芋葉片攜帶黃瓜花葉病毒，檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明魔芋葉片黃瓜花葉病毒ELISA的靈敏度較低。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

接種黃瓜花葉病毒的魔芋葉片在RT-PCR檢測(cè)下沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，而陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出約230 bp的目的條帶（圖3），說(shuō)明盡管魔芋葉片表現(xiàn)出典型的感染黃瓜花葉病毒的癥狀，但是其帶毒量相對(duì)辣椒的帶毒量低很多，普通PCR難以檢測(cè)出。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果

魔芋葉片黃瓜花葉病毒Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，陽(yáng)性對(duì)照與測(cè)試樣品均檢測(cè)到了熒光信號(hào)，測(cè)試樣品的熒光信號(hào)CT=30，大約36個(gè)循環(huán)左右達(dá)到平臺(tái)期，通過(guò)熔解曲線來(lái)看，條帶特異性較強(qiáng)，基本能確定是目的序列的擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增條帶的序列與公布的黃瓜花葉病毒的對(duì)應(yīng)序列覆蓋率可達(dá)到100%，相似性最高達(dá)到99%，說(shuō)明所得DNA片段是CMV的基因片段。結(jié)果表明，利用Real-time PCR能夠準(zhǔn)確檢測(cè)魔芋植株中的CMV。

3 討論

以往的試驗(yàn)對(duì)魔芋中黃瓜花葉病毒的研究較少，檢測(cè)較為困難，本試驗(yàn)選擇了ELISA、RT-PCR和Real-time PCR 3種方法檢測(cè)魔芋葉片中黃瓜花葉病毒并進(jìn)行了比較，結(jié)果表明ELISA與RT-PCR都無(wú)法有效地檢驗(yàn)出魔芋中的黃瓜花葉病毒，這是因?yàn)槟в笕~片上黃瓜花葉病毒帶毒量較低，且葉片中多糖的理化性質(zhì)與RNA很相似，在去除多糖的同時(shí)RNA也隨之被帶走，造成RNA產(chǎn)量下降；而在沉淀RNA的同時(shí)，多糖也隨之被沉淀，這樣很難將二者分離，從而造成一定量RNA的降解和丟失。含有多糖的RNA沉淀難溶于水或溶解后的溶液很黏稠，這會(huì)抑制很多酶的活性[12]，致使最后得到的RNA濃度較低，用普通檢測(cè)方法很難將其檢出。

Real-time PCR技術(shù)是最近幾年發(fā)展最快的技術(shù)之一，它由熒光技術(shù)和普通PCR擴(kuò)增系統(tǒng)相結(jié)合，克服了普通PCR技術(shù)的不足，且簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，特異性和靈敏度都較高，其靈敏度可達(dá)到普通PCR反應(yīng)的100倍[11]。尤其是利用SYBR Green I熒光染料進(jìn)行的Real-time PCR成本較低，可有效檢測(cè)出魔芋葉片中黃瓜花葉病毒，可運(yùn)用于魔芋種植區(qū)的魔芋黃瓜花葉病毒病的檢測(cè)中。此外，該方法可以對(duì)病毒載量進(jìn)行絕對(duì)定量，并且該技術(shù)也可用于研究CMV在植株體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)、抗病種質(zhì)資源的篩選、寄主-病毒-介體間相互作用等。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉佩瑛.魔芋學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2] 劉文洪，陳集雙，李永偉.侵染天南星科植物病毒的分子鑒定及其分子生態(tài)學(xué)研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（4）：566-570.

[3] 張仲凱，李 毅.云南植物病毒[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[4] AYO-JOHN E I，EKPO E J A，ODEDARA O O，et al.Virus symptom expressions on Musa landraces in 1999，2000 and 2004 in southern Nigeria： Cucumber mosaic virus（ CMV） disease incidence and subgroup differentiation[J].Arch Phytopathol Plant Protect，2011，44（6）： 547-557.

[5] JACQUEMOND M.Cucumber mosaic virus[J]. Adv Virus Res，2012，84：439-504.

[6] 王達(dá)新，郭 剛，殷曉敏，等.黃瓜花葉病毒研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：121-123.

[7] JERIDI M，BAKRY F，ESCOUTE J，et al.Homoeologous chromosome pairing between the A and B genomes of Musa spp. revealed by genomic in situ hybridization[J]. Ann Bot，2011，108（5）：975-981.

[8] JOTHIKUMARA N，KANG G， HILL V R.Broadly reactive TaqMan assay for real-time RT-PCR detection of rota virus in clinical and environmental samples[J]. J Virol Methods，2009， 155（2）：126-131.

[9] CATRIONA L， JOHN J，NIAMH S，et al. Real-time reverse transcription PCR detection of norovirus， sapovirus and astrovirus as causative agents of acute viral gastroenteritis[J]. J Virol Methods，2007，146（2）：36-44.

[10] 劉小榮，張 笠，王勇平.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的理論研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（2）：329-332.

[11] 孫 潔，王 婉，周 翎，等.黃瓜花葉病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（2）：53-56.

[12] 王 飛，姚明華.辣椒黃瓜花葉病毒RNA提取及RT-PCR體系建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（4）：776-777.