摘要：以蘋果砧木山定子（Malus baccata）為試材，根據(jù)小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）中克隆得到的尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1（登錄號(hào)：DQ403256）的全長序列設(shè)計(jì)特異引物，通過RT-PCR方法從山定子cDNA中克隆到Nas1基因并命名為MbNas1，該基因全長為978 bp。預(yù)測該基因可編碼325個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.26，相對分子質(zhì)量為36.09 ku。Real-time PCR結(jié)果表明，正常供鐵（EDTA-NaFe，40 μmol/L）時(shí)，該基因在山定子水培苗的新葉、老葉、根、莖的韌皮部中均有表達(dá)，在木質(zhì)部表達(dá)量較低；缺鐵處理（4 μmol/L）時(shí)，該基因在根和新葉中的表達(dá)加強(qiáng)，第6天達(dá)到最高值，之后開始下降；在老葉中表達(dá)逐漸減弱；高鐵處理（160 μmol/L）時(shí)，該基因在根和新葉中的表達(dá)減弱，在第9天達(dá)到最小值，之后有所上升；在老葉中表達(dá)逐漸增強(qiáng)?；驑寔喖?xì)胞定位試驗(yàn)表明，MbNas1蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。

關(guān)鍵詞：山定子（Malus baccata）；尼克煙酰胺合成酶基因（MbNas1）；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2260-04

鐵是植物生長發(fā)育過程不可或缺的微量營養(yǎng)元素之一，缺鐵可導(dǎo)致缺鐵失綠癥——黃葉病，使光合作用降低，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。鐵元素還存在著不穩(wěn)定性，過量對細(xì)胞有毒害，因而在植物體內(nèi)必須與別的物質(zhì)螯合才能進(jìn)行運(yùn)輸和分配[2]。高等植物韌皮部和嫩葉中尼克煙酰胺作為主要的鐵螯合物參與鐵的運(yùn)輸過程[3]，而尼克煙酰胺合成酶（Nas）基因作為主要的限制酶基因在整體的調(diào)控中起到了重要的作用。近年來，Nas基因已陸續(xù)在大麥、水稻、玉米、擬南芥、番茄和蘋果砧木小金海棠中被分離出來，成為研究的熱點(diǎn)。

山定子（Malus baccata）作為常用的優(yōu)良蘋果砧木，耐寒、耐鹽堿、根系發(fā)達(dá)，但以山定子為砧木的蘋果樹在缺鐵的條件下易發(fā)生缺鐵失綠癥[4]，屬于鐵低效基因型品種，而小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）則為鐵高效基因型蘋果砧木[5]，前期已從小金海棠中克隆到了尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1，研究發(fā)現(xiàn)鐵脅迫處理影響該基因的表達(dá)[3]。為了探明不同鐵效率的蘋果砧木中Nas基因表達(dá)情況的區(qū)別以及對鐵脅迫處理反應(yīng)的差異，本試驗(yàn)從山定子中克隆到Nas1基因并分析其在鐵脅迫處理下的表達(dá)模式，進(jìn)而為研究植物抗性機(jī)理及鐵低效砧木的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

山定子組培苗的組織培養(yǎng)和水培方法參照張柳霞等[6]的方法。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 待水培苗長出10～12片真葉時(shí)進(jìn)行缺鐵脅迫處理（EDTA-NaFe，4 μmol/L）和高鐵處理（EDTA-NaFe，160 μmol/L）。取正常供鐵處理?xiàng)l件下水培苗的新葉（頂端第1～2片未完全展開的葉子）、老葉（頂端數(shù)第9～10片完全展開的葉子）、白色新生根、韌皮部和木質(zhì)部，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫辉谌辫F處理和高鐵處理的0、1、3、6、9 和12 d 后，分別取缺鐵和高鐵處理?xiàng)l件下水培苗的新葉、老葉、白色新生根，液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中木質(zhì)部和韌皮部的取材方法采用Han等[7]的方法。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 采用改良的CTAB法[8]對不同組織的總RNA進(jìn)行提取。用1 μL總RNA和1 μL反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 基因全長的獲得 根據(jù)蘋果砧木小金海棠的MxNas1基因（登錄號(hào)：DQ403256）全長設(shè)計(jì)特異性引物F1（5′-ATGTGTTGCCAGGGAGATGCT-3′）、R1（5′-TTAAAGCTGCTCCTCGAAGGC-3′）進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：高保真DNA聚合酶1 μL（5U/μL），ddH2O 21 μL、2×HiF Mix（0.5 U/μL）25 μL、上、下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL和模板1.0 μL。PCR 全長擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化后連接到pEASY-T1 Simple 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，陽性克隆菌液送北京六合華大基因公司測序。

1.2.4 MbNas1基因的序列分析 利用DNAMAN 5.2 軟件將測序獲得的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并預(yù)測該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；利用http：//www.ncbi.nlm.nih 網(wǎng)站進(jìn)行MbNas1基因的氨基酸和核苷酸相似性分析，并從中挑選了葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子等來源于不同植物編碼的尼克煙酰胺合成酶Nas基因的氨基酸序列，將這些序列與山定子尼克煙酰胺合成酶基因的氨基酸序列進(jìn)行比對，然后構(gòu)建同源進(jìn)化樹。

1.2.5 MbNas1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 將cDNA 稀釋5倍后取2 μL 進(jìn)行熒光定量PCR，所用染料為IQ SYBR Green Supermix（購自大連寶生物工程有限公司）， 采用7500 Real-time PCR System （ABI）進(jìn)行測定， 用一步法進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin 為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：cDNA 模板（25 ng/μL） 2 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各0.3 μL，SYBR Green Super Mix 10 μL，染料ROX 0.4 μL為內(nèi)參，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，55 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。所用引物序列如表1所示。

1.2.6 MbNas1基因亞細(xì)胞定位 在基因開放閱讀框的兩端加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，之后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切MbNas1的PCR產(chǎn)物和pEZS-NL質(zhì)粒，將MbNas1基因插入到pEZS-NL載體的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建MbNas1-GFP的瞬時(shí)表達(dá)載體。采用基因槍法將含有對照質(zhì)粒和MbNas1-GFP 質(zhì)粒的金粉轟擊到洋蔥表皮細(xì)胞中，置于MS培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h。利用掃描共聚集熒光顯微鏡（Nikon-ECLIPSE 80i型）觀察洋蔥表皮的熒光情況[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MbNas1基因的克隆

以山定子正常供鐵條件下葉的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得MbNas1基因的全長，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到的條帶大小約978 bp（圖1）。

2.2 MbNas1基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件分析表明，MbNas1基因編碼325個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為36.09 ku，理論等電點(diǎn)為5.26，其cDNA序列及預(yù)測編碼的氨基酸序列如圖2所示。

2.3 同源性分析

利用DNAMAN 5.2軟件將MbNas1基因的氨基酸與來自葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子的尼克煙酰胺合成酶的氨基酸序列進(jìn)行比對，各序列之間存在著不同程度的差異（圖3A）。根據(jù)氨基酸序列比對結(jié)果，利用DNAMAN 5.2軟件構(gòu)建了山定子MbNas1與葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子等物種間的尼克煙酰胺合成酶同源進(jìn)化樹（圖3B），所選物種Nas氨基酸的同源性均在82%～98%之間，其中山定子MbNas1與小金海棠親緣關(guān)系最近，同源性為98%；其次是金冠，同源性為92%；再次是草莓和橙子，同源性分別為87%、86%；而與葡萄、百脈根、蓖麻等其余物種的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

2.4 MbNas1基因的表達(dá)特性分析

取山定子正常供鐵處理后根、新葉、老葉、韌皮部、木質(zhì)部的總RNA進(jìn)行Real-time PCR分析（圖4A）：正常供鐵時(shí)，MbNas1基因在山定子的根、新葉、老葉、韌皮部中均有表達(dá)，在木質(zhì)部中表達(dá)量較低。分別提取山定子缺鐵和高鐵處理0、1、3、6、9、12 d的根、新葉、老葉的總RNA，進(jìn)行Real-time PCR分析（圖4B、4C），缺鐵處理（4 μmol/L）時(shí)，隨處理時(shí)間的增加，該基因在根和新葉中的表達(dá)先加強(qiáng)后減弱，第6天時(shí)達(dá)到最高值，之后開始下降；在老葉中表達(dá)逐漸減弱。高鐵處理（160 μmol/L）時(shí)，隨處理時(shí)間的增加，該基因在根和新葉中的表達(dá)逐漸減弱，在第9天達(dá)到最小值，之后有所上升；在老葉中表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

2.5 MbNas1的亞細(xì)胞定位

利用基因槍法將對照35S：GFP質(zhì)粒和重組質(zhì)粒MbNas1-GFP轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中，在顯微鏡下可觀察到，對照洋蔥表皮細(xì)胞整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光出現(xiàn)，而MbNas1-GFP 綠色熒光僅存在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上（圖5）。表明，MbNas1蛋白質(zhì)已經(jīng)定位在細(xì)胞膜上。

3 小結(jié)與討論

蘋果砧木山定子極其耐寒，但屬于鐵低效基因型植物，在缺鐵的條件下，以山定子為砧木的蘋果樹極易發(fā)生黃化現(xiàn)象，本試驗(yàn)首次從山定子中克隆到尼克煙酰胺合成酶基因，命名為MbNas1，對該基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，并與小金海棠、金冠、草莓等其他物種尼克煙酰胺合成酶基因表達(dá)的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其同源性很高，因此認(rèn)為MbNas1基因?qū)儆谀峥藷燉０泛铣擅富蚣易宓囊粏T。通過洋蔥表皮亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MbNas1基因編碼的蛋白質(zhì)已定位在細(xì)胞膜上。

利用Real-time PCR分析了正常供鐵條件下MbNas1基因在山定子的根、新葉、老葉、韌皮部和木質(zhì)部中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在新葉中該基因表達(dá)量最高，其次是根和老葉。利用Real-time PCR分析在缺鐵脅迫和高鐵處理的條件下，該基因在根、新葉和老葉中的表達(dá)情況，結(jié)果表明缺鐵能夠影響MbNas1基因在山定子內(nèi)的表達(dá)，即該基因能夠?qū)ν饨玷F脅迫的環(huán)境作出應(yīng)答反應(yīng)。隨著缺鐵時(shí)間的延長，根和新葉中MbNas1基因的表達(dá)趨勢均為先上升后下降，老葉中表達(dá)逐漸減弱。在缺鐵脅迫下，植物可以通過促進(jìn)尼克煙酰胺的合成來增加鐵的吸收，而加強(qiáng)MbNas1基因的表達(dá)可以促進(jìn)尼克煙酰胺的合成，從周圍環(huán)境中吸收更多的鐵。從本試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，缺鐵處理6 d 后MbNas1基因的表達(dá)開始呈下降趨勢，可能當(dāng)尼克煙酰胺積累到一定程度后，MbNas1基因表達(dá)趨勢減緩。在高鐵處理?xiàng)l件下，山定子不需要通過合成更多的尼克煙酰胺來增加鐵的吸收，因此，不需要增強(qiáng)MbNas1基因的表達(dá)。

研究結(jié)果表明，低鐵脅迫可使小金海棠和山定子中尼克煙酰胺的含量上升，但小金海棠中尼克煙酰胺的含量上升得較快且幅度較大[10]。本試驗(yàn)也證實(shí)缺鐵脅迫時(shí)山定子與小金海棠中Nas1基因的表達(dá)趨勢有較大的區(qū)別。在分析小金海棠尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1在缺鐵條件下的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)根中MxNas1基因的表達(dá)量在缺鐵處理24 h時(shí)達(dá)到最高[3]，而本試驗(yàn)中的MbNas1基因的表達(dá)量在缺鐵處理第6天才達(dá)到最高，這與測定的小金海棠和山定子中尼克煙酰胺合成酶含量變化趨勢一致，而這種Nas1基因表達(dá)模式和反應(yīng)速度的差異可能是導(dǎo)致山定子和小金海棠對鐵應(yīng)答速度不同的原因之一。

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