摘要：為探討畢節(jié)小檗（Berberis guizhouensis）2個(gè)居群的遺傳變異性和相似性，用聚丙酰胺垂直板凝膠電泳技術(shù)對(duì)畢節(jié)小檗2個(gè)居群的細(xì)胞色素氧化酶（COD）同工酶和過(guò)氧化物酶（POD）同工酶進(jìn)行研究。結(jié)果表明，畢節(jié)小檗2個(gè)居群20株植株P(guān)OD同工酶酶帶數(shù)為8條，其中有4條共同酶帶（POD-3、POD-5、POD-7、POD-8）；COD同工酶酶帶數(shù)為7條，其中也有4條共同酶帶（COD-3、COD-5、COD-6、COD-7）。不同居群的同工酶酶譜存在差異，同一居群的不同同工酶酶譜也存在差異；韭菜坪居群的分化程度大于艾家坪居群。

關(guān)鍵詞：畢節(jié)小檗（Berberis guizhouensis）；細(xì)胞色素氧化酶；過(guò)氧化物酶； 同工酶分析

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2264-03

小檗屬（Berberis L.）植物全世界約有500種，主產(chǎn)北溫帶，中國(guó)有250多種，主要分布于西部及西南部[1]。貴州省有26種1個(gè)變種[2]，據(jù)初步調(diào)查，六盤(pán)水有24種1個(gè)變種[3]。其中，畢節(jié)小檗（Berberis guizhouensis）為貴州省特有小檗屬藥用植物[4]。小檗屬植物俗稱三顆針，主要含尖刺堿（Oxyacanthine）、小檗胺（Berbamine）、小檗堿（Berberine）、藥根堿（Jatrorrhizine）、巴馬亭（Palmatine）等生物堿[5]，具有抗菌消炎、清熱解毒、降壓、利膽、抗心律失常和抗癌等作用[6]。許多種類可作黃連、黃柏的代用品。

李紅寧等[7]對(duì)金花小檗（Berberis wilsonae）、威寧小檗（Berberis weiningensis）及永思小檗（Berberis tsienii）的過(guò)氧化物酶（POD）同工酶進(jìn)行了研究，關(guān)于畢節(jié)小檗同工酶的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。同工酶作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，是生物發(fā)生遺傳分化的證據(jù)，在進(jìn)化中具有一定的保守性，不僅可以用來(lái)揭示生物居群遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)，了解種內(nèi)、種間及種以上遺傳多樣性的情況，而且還可以用來(lái)判斷其繁育系統(tǒng)的性質(zhì)及生殖方式[8]。POD、細(xì)胞色素氧化酶（COD）同工酶屬于氧化還原酶類，在植物中普遍存在，是生物的遺傳標(biāo)記，它的酶譜在一定條件下較穩(wěn)定，對(duì)于品種鑒定，親緣關(guān)系推斷等具有一定的價(jià)值[9]。

本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)畢節(jié)小檗兩個(gè)居群的過(guò)氧化物酶、細(xì)胞色素氧化酶同工酶進(jìn)行了比較研究，探討其居群間的遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性，旨在為小檗屬植物的合理開(kāi)發(fā)利用等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

畢節(jié)小檗于2011年11月在貴州省西部的威寧縣艾家坪和六盤(pán)水鐘山區(qū)韭菜坪采集，其中艾家坪居群隨機(jī)采集了12株植物（海拔2 250～2 300 m），韭菜坪居群隨機(jī)采集了8株植物（海拔2 300～ 2 400 m）。憑證標(biāo)本存放于六盤(pán)水師范學(xué)院生命科學(xué)系植物標(biāo)本室。

1.2 方法

樣品制備按照李紅寧等[7]的方法，電泳按照孫愛(ài)群等[10]的方法。

過(guò)氧化物酶同工酶染色參照胡能書(shū)等[11]的聯(lián)苯胺法：取聯(lián)苯胺0.1 g，加入無(wú)水乙醇5 mL、1.5 mol/L乙酸鈉10 mL、1.5 mol/L乙酸10 mL、蒸餾水75 mL、H2O2原液6滴，混合即為染色液。將電泳凝膠放入染色液中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30～60 min即可。細(xì)胞色素氧化酶同工酶染液配方[12]為1%二甲基對(duì)苯二胺∶1% α-萘酚（溶于40%乙醇）∶0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4） =1∶1∶25（體積比）。

染色后對(duì)酶帶進(jìn)行測(cè)量、記錄和拍照，并計(jì)算其相對(duì)遷移率（Rf），Rf=酶帶遷移距離（cm）/溴酚藍(lán)遷移距離（cm）。以同工酶縮寫(xiě)名稱的大寫(xiě)字母代表酶蛋白，以1、2、3表示向陽(yáng)極遷移的位點(diǎn)，越靠近陽(yáng)極的位點(diǎn)以越小的數(shù)字表示，如POD-1、POD-2等。

相似度指數(shù)=2個(gè)類群植物相同酶帶數(shù)/（2個(gè)類群植物相同酶帶數(shù)+2個(gè)類群植物不同酶帶數(shù)）[13]。依據(jù)數(shù)量分類中二態(tài)特征的0/1編碼原則[14]對(duì)每個(gè)個(gè)體的每條酶帶賦值，首先將各樣本看成一類，有酶帶計(jì)為1，無(wú)酶帶計(jì)為0，應(yīng)用DPS v7.55軟件中的Jaccard系數(shù)，用類平均法（UPGMA）對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢節(jié)小檗POD同工酶酶譜分析

經(jīng)過(guò)分析，畢節(jié)小檗2個(gè)居群20株植株P(guān)OD同工酶譜共有8條酶帶（圖1），其中有4條為共同酶帶（POD-3、POD-5、POD-7、POD-8）。艾家坪居群酶帶數(shù)為3～7條，韭菜坪居群酶帶數(shù)為2～6條。韭菜坪居群的第3株植株無(wú)POD-8酶帶。共同酶帶在兩居群中的表現(xiàn)特征為POD-3、POD-5韭菜坪居群表達(dá)較強(qiáng)，艾家坪居群表達(dá)強(qiáng)弱不等； POD-7、POD-8 2個(gè)居群大部分植株表達(dá)較強(qiáng)。

2.2 畢節(jié)小檗COD同工酶酶譜分析

畢節(jié)小檗2個(gè)居群20株植株COD同工酶譜共有7條酶帶（圖2），其中有4條共同酶帶（COD-3、COD-5、COD-6、COD-7）。艾家坪居群酶帶數(shù)為4～6條，韭菜坪居群酶帶數(shù)為3～5條。艾家坪居群A-2、A-3、A-8、A-11植株及韭菜坪居群B-16、B-17、B-18、B-19植株均具有COD-2酶帶；艾家坪居群A-11植株還具有COD-1酶帶。此外，韭菜坪居群B-17植株無(wú)COD-3、COD-5酶帶，具有特有酶帶COD-4。共同酶帶COD-3、COD-5、COD-6、COD-7在2個(gè)居群中的表現(xiàn)特征為COD-3、COD-5表達(dá)活性較強(qiáng)，COD-6、COD-7表達(dá)活性稍弱。

2.3 POD與COD同工酶的聚類分析

采用DPS v7.55軟件對(duì)畢節(jié)小檗POD與COD同工酶進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。畢節(jié)小檗POD同工酶聚類分析表明，供試的20株植株可以聚為2個(gè)類群，一個(gè)為艾家坪居群的1-10號(hào)植株，另一個(gè)為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第11、12號(hào)植株；COD同工酶聚類分析表明，供試的20株植株也可以聚為2個(gè)類群，一個(gè)為艾家坪居群的1-11號(hào)植株，另一個(gè)為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第12號(hào)植株，說(shuō)明同工酶水平可以將畢節(jié)小檗2個(gè)居群區(qū)分開(kāi)。

3 小結(jié)與討論

同工酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，很大程度上能反映植物種間及居群間的親緣關(guān)系，可用于居群間生物多樣性的探討[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，畢節(jié)小檗艾家坪居群不同植株的POD同工酶相似度指數(shù)為0.677，韭菜坪居群不同植株P(guān)OD相似度指數(shù)為0.590；而艾家坪居群不同植株的COD同工酶相似度指數(shù)為0.880，韭菜坪居群不同植株COD同工酶相似度指數(shù)為0.728。艾家坪居群POD同工酶及COD同工酶相似度指數(shù)均大于韭菜坪居群，說(shuō)明艾家坪居群植株個(gè)體間分化程度較小，韭菜坪居群植株個(gè)體間分化程度較大。

畢節(jié)小檗2個(gè)居群的POD同工酶共有8條酶帶，其中有4條共同酶帶；兩個(gè)居群的COD同工酶共有7條酶帶，其中也有4條共同的酶帶。兩個(gè)居群POD同工酶相似度指數(shù)為0.606，COD同工酶相似度指數(shù)為0.689。說(shuō)明畢節(jié)小檗不但具有一定程度的遺傳穩(wěn)定性，而且也蘊(yùn)涵著豐富的遺傳多樣性。

畢節(jié)小檗POD同工酶聚類分析結(jié)果表明，供試的20株植株可以聚為2個(gè)類群，一個(gè)類群為艾家坪居群的1-10號(hào)植株，另一個(gè)為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第11、12號(hào)植株，兩個(gè)居群基本可以區(qū)分。COD同工酶聚類分析表明，供試植株也可以聚為2個(gè)類群，一個(gè)為艾家坪居群的1-11號(hào)植株，另一個(gè)為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第12號(hào)植株，兩個(gè)居群也可以區(qū)分，說(shuō)明艾家坪居群與韭菜坪居群間有一定程度的分化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 應(yīng)俊生，陳德昭.中國(guó)植物志（第29卷）[M].北京：科學(xué)出版社，2001.54-214.

[2] 陳謙海.貴州植物志（第10卷）[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2004.11-37.

[3] 林長(zhǎng)松，左經(jīng)會(huì)，廖 雯.六盤(pán)水小檗屬植物資源及其開(kāi)發(fā)利用前景[J].六盤(pán)水師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2007，19（6）：6-10.

[4] 孫濟(jì)平，何順志.貴州特有藥用植物的種類與分布[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（10）：735-738.

[5] 呂光華，王立為，陳建民，等.小檗屬植物中的生物堿成分測(cè)定及資源利用[J].中草藥，1999，30（6）：428-430.

[6] 馬志剛，馬秀英，楊平榮.我國(guó)30年來(lái)對(duì)小檗屬藥用植物的研究[J].甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)，1999，11（1）：75-77.

[7] 李紅寧，孫愛(ài)群，左經(jīng)會(huì)，等.貴州3種小檗屬植物種間的親緣關(guān)系[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（10）：11-16.

[8] 王中仁.植物遺傳多樣性和系統(tǒng)學(xué)研究中的等位酶分析[J]. 生物多樣性，1994，2（1）：38-43.

[9] 鄒春靜，盛曉峰，韓文卿，等.同工酶分析技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)雜志，2003，22（6）：63-69.

[10] 孫愛(ài)群，蘇 麗，周 未，等.雙團(tuán)棘胸蛙與棘腹蛙酯酶同工酶的比較研究[J].四川動(dòng)物，2011，30（2）：236-238.

[11] 胡能書(shū)，萬(wàn)賢國(guó).同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M].長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985.74-75.

[12] 何效忠，張樹(shù)政.電泳[M].北京：科學(xué)出版社，1999.287.

[13] VAUGHAN J G，DENFORD K E. An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica and Sinapsis species，with special reference to their taxonomic value[J]. J Exp Bot，1968，19（61）：724-732.

[14] 徐克學(xué).數(shù)量分類學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1994.