摘要：采用組織分離法從銀杏（Ginkgo biloba）健康組織中分離得到25株內(nèi)生真菌，根據(jù)菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，5株被鑒定為鏈孢霉菌屬、4株為酵母屬、4株為曲霉屬，3株為毛霉屬、3株為青霉屬，2株為根霉屬，1株為簡(jiǎn)梗孢霉屬，3株分離菌株不產(chǎn)孢子。測(cè)定25株內(nèi)生真菌對(duì)3種受試指示菌的抑制作用，共篩選得到11株至少對(duì)一種指示菌的生長(zhǎng)有抑制作用的菌株，對(duì)抑菌活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和顯微分析鑒定。

關(guān)鍵詞：分離；鑒定；銀杏（Ginkgo biloba）；內(nèi)生真菌；抑菌性

中圖分類號(hào)：S664.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2116-04

自第一株內(nèi)生真菌1898年從黑麥草種子中分離出來(lái)以后，植物內(nèi)生真菌才被廣泛地關(guān)注。內(nèi)生菌最早是指在植物組織內(nèi)生長(zhǎng)的微生物，用來(lái)區(qū)分那些在植物表面上生長(zhǎng)的表生菌?，F(xiàn)內(nèi)生真菌定義為在其生活史的一定階段或全部階段，在健康植物組織和器官內(nèi)部中生長(zhǎng)的，且不會(huì)使其被感染的宿主（至少是暫時(shí)）表現(xiàn)出外在病癥的一類真菌。內(nèi)生真菌多樣性豐富，生物活性強(qiáng)，生長(zhǎng)在植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌可以和相對(duì)應(yīng)的宿主相互協(xié)同、共同進(jìn)化，并且還可以生成與宿主相同或相似的具有生物活性的代謝產(chǎn)物[1]，它們不僅能促進(jìn)宿主植物快速生長(zhǎng)，而且還可有效地增強(qiáng)宿主對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗逆能力。已有研究表明，植物內(nèi)生真菌可以分泌一些新的活性物質(zhì)對(duì)不同細(xì)菌、病原真菌產(chǎn)生抑制作用[2-5]。

銀杏樹（Ginkgo biloba）又名白果樹，是第四紀(jì)冰川運(yùn)動(dòng)后遺留下來(lái)的最古老的裸子植物，是世界上珍貴樹種之一，被稱作植物界中的“活化石”。它生長(zhǎng)較慢，壽命極長(zhǎng)，自然條件下從栽種到結(jié)銀杏果需要20多年，40年后才能大量結(jié)果。大多數(shù)植物在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到幾種甚至幾十種病原菌的侵襲，但銀杏在這漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程中卻很少發(fā)生病害，這可能與銀杏內(nèi)部含有特殊的內(nèi)生真菌有關(guān)。本試驗(yàn)采用植物組織分離法從銀杏的根、莖、葉中分離得到25株內(nèi)生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)及顯微分析對(duì)獲得的菌種進(jìn)行初步鑒定，并測(cè)定其抑菌性，篩選出具有較高抑菌性的銀杏內(nèi)生真菌，對(duì)新型抑菌生物制劑的開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

商丘師范學(xué)院校園內(nèi)采摘的新鮮健康無(wú)病蟲害的銀杏根、莖、葉。

1.2 供試指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）由植物與微生物互作河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：稱取成品孟加拉紅培養(yǎng)基粉末31.6 g，加去離子水稀釋至1 L。

PDA固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，去離子水1 L，在使用前，加100 mg的氨芐青霉素和100 mg的鏈霉素。

PDA液體培養(yǎng)基：在PDA固體培養(yǎng)基制作基礎(chǔ)上去除瓊脂。

查氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，pH 7.2。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，加去離子水至1 L，pH 7.0。

LB液體培養(yǎng)基：在LB固體培養(yǎng)基制作基礎(chǔ)上去除瓊脂。

1.4 方法

1.4.1 銀杏內(nèi)生真菌的分離 將清洗過(guò)的銀杏根晾干，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)處理。去離子水沖洗根，濾紙吸干水分，75%酒精處理30 s，再用0.1%的升汞處理1、2、3 min（內(nèi)生真菌分離試驗(yàn)中，升汞滅菌時(shí)間的控制尤為重要，故將升汞滅菌時(shí)間設(shè)為3個(gè)梯度），去離子水沖洗3次，濾紙吸干。最后一次清洗液，作為對(duì)照組，判斷滅菌是否徹底。將根切成1 cm小段，用無(wú)菌鑷子將根置于含有孟加拉紅培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿3～4個(gè)，重復(fù)3次。對(duì)銀杏莖、葉及葉柄內(nèi)生真菌的分離同根內(nèi)生真菌分離，莖和葉柄，切成0.5 cm左右小段，葉切成1 cm長(zhǎng)寬的小片。

將接種后的培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)4～8 d。待培養(yǎng)基上各植物組織周圍長(zhǎng)出菌絲后，參照對(duì)照組，判斷滅菌是否徹底。選取緊挨根、莖、葉及葉柄生長(zhǎng)的菌落，最好是以本體為中心發(fā)散生長(zhǎng)的真菌（超出8 d還未長(zhǎng)出菌絲的，可放棄）。挑選未污染的，具有相異特征的真菌菌落留下備用。重復(fù)該過(guò)程，在多次實(shí)驗(yàn)中，確定最佳試驗(yàn)方法，豐富獲得內(nèi)生真菌的多樣性。

1.4.2 銀杏內(nèi)生真菌的純化和保存 于超凈工作臺(tái)，挑取菌絲，轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA培養(yǎng)基，每株重復(fù)3個(gè)平板，然后28 ℃恒溫培養(yǎng)，該過(guò)程重復(fù)3～5次，直至菌落呈現(xiàn)單菌落形態(tài)。將已純化的菌株分別轉(zhuǎn)移至查氏培養(yǎng)基內(nèi)，每株保存2～3個(gè)斜面培養(yǎng)基。

1.4.3 形態(tài)學(xué)鑒定 將得到的純菌株按顏色、菌落形狀、生長(zhǎng)狀況初步分類[6，7]。

1.4.4 抑菌性鑒定 采用平板打孔法做抑菌性試驗(yàn)[8]。選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌為指示菌。于LB固體培養(yǎng)基上劃線，活化指示菌。指示菌生長(zhǎng)旺盛時(shí)，挑取些許轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)1 d即可。同時(shí)，將得到的銀杏內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接入PDA培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行活化培養(yǎng)2～4 d。在指示菌和內(nèi)生真菌都生長(zhǎng)旺盛時(shí)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)鑒定。分別吸取指示菌菌液200 μL于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行均勻涂布。然后用直徑4.5 mm的打孔器切取菌餅，將銀杏內(nèi)生真菌的菌餅（3塊）置于涂有菌液的LB培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，并以無(wú)菌培養(yǎng)基打孔代替菌餅為對(duì)照。相對(duì)抑菌率=（抑菌圈直徑-菌餅直徑）/菌餅直徑×100%。

1.4.5 顯微形態(tài)學(xué)分析 挑選抑菌性較強(qiáng)的菌株，于顯微鏡下觀察菌株的菌絲形態(tài)、孢子等顯微形態(tài)學(xué)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的初步鑒定

從銀杏組織中共分離出25種菌株，根中12種，莖中8種，葉中5種，根據(jù)其菌落大小、形態(tài)、顏色等表型特征對(duì)25種菌株進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果見表1。25種菌株中有11種有不同程度的抑菌性，占總菌數(shù)的44%。具有抑菌效果的菌株中鏈孢霉菌屬4株，曲霉屬3株，青霉屬3株，根霉屬1株（表2）。

2.2 抑菌性對(duì)比

11種具有抑菌性的菌株中，有1種菌對(duì)3種指示菌均有抑制作用，有5種菌對(duì)2種指示菌有抑制作用，5種菌只對(duì)其中1種指示菌有抑制作用。選用的指示菌中，巨大芽孢桿菌的指示效果最為明顯，敏感度較強(qiáng)，有9株對(duì)其有抑制作用；其次是枯草芽孢桿菌，有7株對(duì)其有抑制作用；大腸桿菌最差，僅有2株對(duì)其有抑制作用。

分離菌株J2a抑菌范圍廣，對(duì)巨大芽孢桿菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為1.2、1.2、1.6 cm；分離菌株J3a對(duì)巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為1.6 cm和1.4 cm；而分離菌株G21僅對(duì)巨大芽孢桿菌有抑菌效果，抑菌圈直徑達(dá)1.8 cm。對(duì)菌株J2a、J3a和G21進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微形態(tài)學(xué)分析（圖1-3），將其分別鑒定歸類為鏈孢霉屬、曲霉屬和根霉屬。而進(jìn)一步的種類鑒定需進(jìn)行分子生物學(xué)分析。

3 小結(jié)與討論

由于銀杏種質(zhì)資源豐富，對(duì)其內(nèi)生真菌的分離研究在開發(fā)抑菌生物制劑方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9，10]。本試驗(yàn)從銀杏組織中分離得到25種菌種，其中有11種具有抑菌作用。從11種具有抑菌效果的菌種中篩選出3種抑菌效果較好的菌株J2a、J3a、G21?？蛇M(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)鑒定確定其屬種名，并分析其可能產(chǎn)生的抑菌性生物活性化合物及抑菌機(jī)理，開發(fā)新型抗菌劑。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物組織的滅菌條件、培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)溫度等均對(duì)內(nèi)生真菌的分離尤為重要，試驗(yàn)結(jié)果表明，材料最佳表面滅菌條件是75%酒精處理30 s后，0.1%升汞處理2 min；在初分離時(shí)選用孟加拉紅培養(yǎng)基，可防止放線菌污染；生長(zhǎng)溫度以26～28 ℃為宜。

參考文獻(xiàn)：

[1] STIERLE A，STROBEL G，STIERLE D. Taxol and taxane production by Tanomyces andreanea，an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993（260）：214-216.

[2] ZOU W X，MENG J C，LU H，et al. Metabolites of Colletotrichum gloeosporioides，an endophyttic fungus in Artemisia mongolica[J]. Journal of Natural Products，2000，63（11）：1529-1530.

[3] 劉小莉，周劍忠，黃開紅，等.古銀杏內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（10）：1513-1518.

[4] 吳小文，郭正彥，柏 鈺，等.雪松內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，39（4）：619-623.

[5] 徐亞軍，趙龍飛，陳 普，等.植物病原菌拮抗性野生艾蒿內(nèi)生菌的分離、篩選和鑒定[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33（12）：3697-3705.

[6] 戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類[M].北京：科學(xué)出版社，1987.

[7] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[8] PEL？魣EZ F，COLLADO J，ARENAL F，et al. Endophytic fungi from plant living on gypsum soils as a source of secondary metablites with antimicrobial activity[J]. Mycological Research，1998，102（6）：755-761.

[9] 申屠旭萍，俞曉平，夏湛恩，等.一株銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抗菌活性初步研究[J].植物保護(hù)，2006，32（3）：55-57.

[10] 王國(guó)平，王麗薇，張亞磊，等.一株銀杏內(nèi)生真菌的鑒定及其活性代謝產(chǎn)物研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（2）：226-234.