摘要：通過(guò)分子PCR檢測(cè)，初步證明在湖北一發(fā)病肉鴿群感染H9亞型禽流感病毒。病原分離后，盲傳3代，其血凝效價(jià)達(dá)到109～1011，經(jīng)生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，其雞胚半數(shù)致死量為107.5， 9日齡雞胚平均致死時(shí)間為 54.3 h，1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)為1.8，6周齡小雞靜脈接種致病指數(shù)為2.0，證明該 H9亞型禽流感為毒力較強(qiáng)。將該病毒回歸非免疫肉鴿，能產(chǎn)生典型的H9亞型禽流感癥狀，采集其肺、喉頭、泄殖腔等病變組織進(jìn)行病毒分離，均可分離到H9亞型AIV。

關(guān)鍵詞：肉鴿；H9亞型禽流感病毒；分離

中圖分類號(hào)：S836 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）09-2170-03

H9亞型禽流感（Avian influenza，AI）是持續(xù)危害中國(guó)及世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要禽類傳染病之一。禽類感染H9亞型禽流感病毒后，常表現(xiàn)為呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低、急性死亡等多種形式[1]。雖然對(duì)禽的致病率低，但可引起生產(chǎn)性能下降，造成免疫抑制，因而在普遍存在復(fù)合感染的情況下，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失也很大。同時(shí)H9N2亞型禽流感病毒還可感染人，提供內(nèi)部序列與H5N1亞型禽流感病毒重組；并且具有人流感病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)[2]，因此研究H9N2亞型AI的病原及防控對(duì)養(yǎng)禽業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

1994年陳伯倫等[3]首次報(bào)道從中國(guó)廣東某雞群分離到H9亞型AIV以來(lái)，陸續(xù)的有文獻(xiàn)報(bào)道在各類雞、鴨、鵪鶉等養(yǎng)殖場(chǎng)有H9亞型AIV發(fā)生和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2014年12月，湖北一肉鴿場(chǎng)1月齡肉鴿出現(xiàn)食欲下降、羽毛蓬松、精神不振、頭頸歪斜或頭扭轉(zhuǎn)置于背上呈觀星狀等典型的神經(jīng)癥狀，死亡率為15%，疑似新城疫或禽流感癥狀。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司；試驗(yàn)鴿由湖北某鴿場(chǎng)提供?？剐鲁且哧?yáng)性血清、抗禽流感陽(yáng)性血清（H5N1、H9N2）、抗減蛋綜合征（EDS76）陽(yáng)性血清由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所制備和保存。

1.2 病料的采集與處理

病料采自湖北某肉鴿場(chǎng)，鴿群日齡26～45日齡。取病變嚴(yán)重的氣管、喉頭和肺臟，剪碎，加2倍的PBS溶液和終濃度為2 000 IU/ml的雙抗，研磨后，反復(fù)凍融2次，置-20 ℃冰箱備用。

1.3 病料的初步檢測(cè)

參照GenBank公布的NDV、H9亞型禽流感病毒基因組序列Primer primere5.0軟件設(shè)計(jì)NDV，引物為：NDV-F-U CCTTGGTGAITCTATCCGIAG，NDV-F-D CTGCCACTGCTAGTTGIGATAATCC，長(zhǎng)度254 bp；禽流感H9（H9AIV）：HA基因檢測(cè)引物H9N2-HA-U CTCCACACAGAGCAYAATGG，H9N2-HA-D GYACACTTGTTGTTGTRTC，長(zhǎng)度488 bp。引物合成由生物工程（上海）有限公司完成。

1.4 0.85%雞紅細(xì)胞制備

取SPF公雞血 5 mL，加 入抗凝劑 ，生理鹽水沖洗，1 500 r/min 離心7 min，反復(fù)操作3次，制備雞紅細(xì)胞懸液 。

1.5 病毒分離

取反復(fù)凍融后的上清液接種9日齡雞胚，每枚雞胚接種0.25 mL，37 ℃孵化120 h ，24 h內(nèi)死胚棄去，取 24～120 h死亡的雞胚，觀察雞胚病變，收獲雞胚有明顯病變的尿囊液，測(cè)定尿囊液是否有血凝性，檢測(cè)有無(wú)細(xì)菌污染，并盲傳3代，測(cè)其血凝效價(jià)（HA）。

1.6 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)

按常規(guī)β-微量法進(jìn)行尿囊液血凝效價(jià)（HA），并以抗NDV、抗禽流感（H5N1、H9N2）、抗減蛋綜合征（EDS）陽(yáng)性血清進(jìn)行 HI 反應(yīng)。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

用分離的病毒尿囊液0.2 mL，分別對(duì)20只30日齡非免疫肉鴿進(jìn)行點(diǎn)眼、滴鼻。觀察10 d，每日記錄發(fā)病和死亡情況，剖檢發(fā)病死亡鴿，取其氣管、肺、泄殖腔等組織進(jìn)行病毒分離。

1.8 分離毒株毒力的測(cè)定

《采用國(guó)際獸醫(yī)局的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》進(jìn)行毒力檢測(cè)，將分離毒株經(jīng)雞胚復(fù)壯一代的尿囊液進(jìn)行試驗(yàn)。1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)的測(cè)定，10日齡雞胚平均致死時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料初步檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，2-4號(hào)樣品用H9AIV特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，3個(gè)樣品均出現(xiàn)480 bp大小的片段，而5-7號(hào)樣品為NDV特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，均無(wú)254 bp大小的片段，說(shuō)明鴿群感染的是H9亞型禽流感病毒。

2.2 病毒分離結(jié)果

經(jīng)尿囊腔接種的SPF雞胚在72 h內(nèi)全部死亡，可見死亡胚全身出血、尿囊膜上也有較多的出血點(diǎn)。測(cè)其尿囊液HA效價(jià)為6～8log2。將尿囊液傳至第3代，死亡胚尿囊液平均HA效價(jià)達(dá)到9～11log2。用分離毒與NDV、H9N2、H5N1、EDS76陽(yáng)性血清做HI試驗(yàn)，其血凝作用可被H9N2陽(yáng)性血清抑制，而不能被NDV、H5N1和EDS76陽(yáng)性血清抑制。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)攻毒的20只肉鴿，36 h后陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、拉水便、呼吸啰音等發(fā)病癥狀，71 h后開始死亡至第14天，共16只死亡。剖檢死亡鴿，發(fā)現(xiàn)喉頭充血、氣管環(huán)出血、肺臟肉變、腺胃乳頭及肌胃與腺胃交接處形成出血帶、胰腺有點(diǎn)狀出血點(diǎn)、十二指腸、泄殖腔黏膜有出血斑。取病死鴿氣管喉頭、肺、泄殖腔組織，進(jìn)行病毒分離，均能分離到H9亞型禽流感病毒，基因序列比較有待進(jìn)一步研究。將攻毒后存活的4只肉鴿血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，其HI效價(jià)為27、27、28、28。

2.4 分離毒株毒力的測(cè)定

經(jīng)毒力測(cè)定，雞胚半數(shù)致死量為107.5/0.2 mL，雞胚平均致死時(shí)間為54.3 h，1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)為1.8，6周齡小雞靜脈接種致病指數(shù)為2.0，可判定該分離株應(yīng)為強(qiáng)毒株。

3 討論

禽流感不僅嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)，而且給公共衛(wèi)生造成巨大威脅。H9N2亞型AIV在我國(guó)（特別是南方地區(qū)）持續(xù)流行，且宿主范圍廣泛，包括雞、鴨、珍珠雞、鵪鶉等[4-7]。發(fā)病情況差別較大，有的出現(xiàn)急性死亡，有的無(wú)癥狀帶毒。但國(guó)內(nèi)對(duì)于鴿子感染發(fā)病的報(bào)道很少，其病原的研究就更少了。

通過(guò)對(duì)發(fā)病鴿群臨床癥狀的觀察，顯示本次發(fā)病鴿群疑似新城疫或禽流感病毒感染，因?yàn)槠浒l(fā)病死亡率相對(duì)較低，不太像高致病性禽流感病毒的感染。新城疫和H9亞型禽流感感染在臨床上很難區(qū)分。本次調(diào)查首先通過(guò)分子生物學(xué)初步診斷，排除了新城疫病毒感染的可能性，判斷為H9亞型禽流感病毒感染。進(jìn)一步進(jìn)行其血凝、血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)及毒力測(cè)定，確定為毒力較高的H9亞型禽流感病毒感染。病毒進(jìn)化分析表明，我國(guó)禽群中主要流行Y280-like和G1-like兩個(gè)分支的H9N2亞型AIV。其中在我國(guó)雞群中主要流行 Y280-like 分支病毒， 而G1-like分支病毒僅在鵪鶉等珍禽中流行。另外，Y439-like和Ty/66-like分支病毒在我國(guó)也偶爾被分離到，但沒(méi)有形成流行[8，9]。本次分離到的H9亞型AIV到底是從哪里傳播來(lái)的？屬于哪個(gè)進(jìn)化分支？還有待于進(jìn)一步進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 甘孟侯.禽流感[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995.

[2] SUN Y， TAN Y， WEI K， et al. Amino acid 316 of hemagglutinin and the neuraminidase stalk length influence virulence of H9N2 influenza virus in chickensand mice[J]. Journal of Virology， 2013， 87（5）： 2963-2968.

[3] 陳伯倫，張澤紀(jì).禽流感研究：I.雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1994，20（10）：3-5.

[4] LI C，YU K，TIAN G， et al. Evolution of H9N2 influenzaviruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology，2005，340（1）：70-83.

[5]XU K， SMITH G， BAHL J，et al.The genesis and evolution of H9N2 influenza viruses in poultry from southern China，2000 to 2005[J]. Journal of Virology， 2007， 81（19）：10389-10401.

[6] XU K， LI K， SMITH G， et al. Evolution and molecular epidemiology of H9N2 influenza A viruses from quail in southern China， 2000 to 2005[J]. Journal of Virology， 2007，81（6）： 2635-2645.

[7]CONG Y L， PU J， LIU Q F， et al. Antigenic and genetic characterization of H9N2 swine influenza viruses in China[J]. Journal of General Virology， 2007， 88（7）： 2035-2041.

[8] SUN Y， PU J， JIANG Z， et al. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2 influenza viruses in China from 1994 to 2008[J]. Veterinary Microbiology， 2010， 146（3）：215-225.

[9] ZHANG Y， YIN Y， BI Y， et al. Molecular and antigenic characterization of H9N2 avian influenza virus isolates from chicken flocks between 1998 and 2007 in China[J]. Veterinary Microbiology， 2012， 156（3）： 285-293.