摘要：為優(yōu)化甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉中綠原酸超聲提取工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比（g：mL，下同）3個對綠原酸提取率影響較大的因素，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計對各因素進行優(yōu)化組合，運用Design Expert 8.05b軟件進行響應(yīng)面回歸分析，建立了綠原酸提取率的二次多項式回歸方程。得到的優(yōu)化組合條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20、超聲時間24 min，綠原酸提取率為3.097 2%，與響應(yīng)面擬合所得方程的預(yù)測值3.106 8%相近。試驗所用甘薯莖葉價廉易得，提取方法高效可行，分析方法可信，可為甘薯莖葉的開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉；綠原酸；超聲提??；響應(yīng)面分析

中圖分類號：S531 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2201-05

綠原酸具有較強的藥理活性，對消化、血液和生殖系統(tǒng)疾病有顯著療效。綠原酸是金銀花、杜仲等中藥材以及復(fù)肝寧、雙花注射液等中成藥的主要有效成分[1]，同時也是某些中藥制劑質(zhì)量監(jiān)控的重要指標(biāo)之一[2]。除醫(yī)用外，綠原酸還可廣泛應(yīng)用于保健食品、飲料[3]以及化妝品等領(lǐng)域[4]。目前，綠原酸主要是從金銀花[5，6]或杜仲[7，8]中提取，多數(shù)產(chǎn)品是浸膏，其含量為15%～30%。金銀花和杜仲是傳統(tǒng)中藥材，亦是食材，需求量大但資源量相對較少。以金銀花和杜仲為原料提取綠原酸，生產(chǎn)成本較高。研究表明[9]，甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉中含綠原酸，是甘薯莖葉主要活性成分之一。甘薯種植廣泛，其莖葉價格低廉，以其為原料提取綠原酸，可大大降低成本。目前，從甘薯莖葉中提取綠原酸的報道較少，并且多為正交設(shè)計[10，11]，不能考察各因素交互作用對綠原酸提取率的影響。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過3因素3水平Box-Behnken中心組合試驗，運用Design Expert 8.05b軟件進行響應(yīng)面回歸分析，建立回歸模型，優(yōu)化綠原酸提取的工藝條件，以期為甘薯莖葉資源的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 甘薯莖葉，采摘于廣西省柳州市，經(jīng)清洗、曬干、烘干（60 ℃烘10 h）、粉碎過篩（40目）后備用。

1.1.2 主要試劑 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%），天津光復(fù)精細化學(xué)品研究所；乙醇、鹽酸等均為分析純，國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3 儀器 UV-9600型紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GZX-DH·400S型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取0.005 0 g綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇定容于100 mL的容量瓶中。準(zhǔn)確移取0、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00 mL該溶液于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容。采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長對綠原酸對照品進行掃描，得出其最大吸收波長為328.8 nm，在328.8 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。擬合得到回歸方程為A=0.046 6C-0.005 1，R2=0.999 8。

1.2.2 綠原酸的提取工藝流程及測定 提取工藝：準(zhǔn)確稱取一定量（過40目篩）干燥甘薯莖葉→按一定料液比加入提取劑→加HCl溶液調(diào)至pH 4→浸泡24 h→在室溫下超聲提取一定時間→抽濾→濾渣重復(fù)提取1次→合并2次濾液→定容（250 mL）。

綠原酸含量測定：準(zhǔn)確移取提取液2.00 mL于25 mL容量瓶，按“1.2.1”的方法在328.8 nm處測定其吸光度。

綠原酸含量（g/mL）=（C×V1×N×V）/（V2×106）

式中，C為綠原酸濃度；V為提取液總體積；V1為取樣量；N為稀釋倍數(shù)；V2為待測溶液體積。

1.2.3 單因素試驗 分別以不同提取劑（水、甲醇、80%乙醇和丙酮）、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同）、超聲時間（15、20、25、30、35 min）為因素，考察各因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計 根據(jù)Box-Behenken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和超聲時間（C）為自變量，甘薯莖葉綠原酸提取率（Y）為響應(yīng)值，進行3因素3水平試驗設(shè)計（表1）。研究各個因素及其交互作用對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響，優(yōu)化綠原酸提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同提取劑對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 綠原酸是含有羥基和鄰苯二酚羥基的有機酸內(nèi)酯，易溶于熱水、醇和丙酮。據(jù)此，選用水、甲醇、80%乙醇和丙酮作溶劑，考察在相同條件下對甘薯莖葉中綠原酸的提取效果，結(jié)果表明，水、甲醇、80%乙醇和丙酮作溶劑時，甘薯莖葉綠原酸提取率分別為2.01%、2.86%、2.73%、2.91%。

4種提取劑中，丙酮和甲醇的提取效果較好，但其本身有毒，價格也較貴。水是既清潔又價廉的提取劑，但其提取效果較差。乙醇的提取率雖然比丙酮和甲醇差，但也可基本滿足需求。由于廣西壯族自治區(qū)富產(chǎn)甘蔗，乙醇是糖廠的副產(chǎn)物之一，來源廣泛。因而，在后續(xù)試驗中，選用乙醇為綠原酸的提取溶劑。

2.1.2 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 在其他條件相同的情況下，不同溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響如圖1所示。當(dāng)乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)小于70%時，隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸提取率增大，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為70%時達到最高值2.95%；之后隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，綠原酸提取率減少。這可能是由于乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)過低，綠原酸溶出不完全，而溶液體積分?jǐn)?shù)過高，一些脂溶性的雜質(zhì)也隨之溶出。因此，在后續(xù)單因素試驗中，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

2.1.3 料液比對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比低于1∶20時，甘薯莖葉綠原酸的提取率隨溶劑量的增加而增加，說明溶劑用量的多少對提取率有較大影響。溶劑量較少時，細胞內(nèi)外的濃度差較大，有利于乙醇快速滲透到細胞內(nèi)部，因而隨溶劑量增加，綠原酸溶出增加，提取率逐漸增大。當(dāng)料液比為1∶20時達到溶解平衡，這時綠原酸提取率達到最大。隨后，料液比增大，綠原酸提取率變化不大。因而，選取1∶20的料液比進行后續(xù)的單因素試驗。

2.1.4 超聲時間對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 超聲波具有空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)[5]，能快速破壞植物細胞，使其內(nèi)部的化學(xué)成分較快溶出。由圖3可知，隨著超聲時間的延長，甘薯莖葉綠原酸的提取率先增加，當(dāng)超聲時間為25 min時達到最大值，隨后有所降低。這可能是隨著超聲時間的增加，植物細胞被破壞的數(shù)目增多，細胞內(nèi)釋放出的化學(xué)成分增多，在提取劑中逐漸達到擴散、溶解平衡時，即綠原酸提取率達到最大值。由于綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，超聲時間過長，會導(dǎo)致部分綠原酸被氧化破壞。而且，超聲時間的延長，使可溶性成分如糖等也有較多溶出，使后期工藝操作困難，綠原酸有所損耗。因此，超聲提取的時間以25 min為宜。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化甘薯莖葉綠原酸提取工藝

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，選取乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間為自變量，綠原酸提取率為響應(yīng)值，進行3因素3水平響應(yīng)面試驗設(shè)計，結(jié)果如表2所示。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 對表2試驗結(jié)果運用Design Expert 8.05b軟件程序進行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型為Y=3.10-2.500×10-3A+0.060B-0.053C-0.088AB-0.087AC+0.083BC-0.21A2-0.17B2-0.12C2。

對表2數(shù)據(jù)進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可知，該二次回歸方程整體模型極顯著，表明該試驗方法可靠。該模型回歸系數(shù)R2=0.992 7>0.9，表明該模型的相關(guān)度較好。方程失擬項小，R2Adj=0.983 3，變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）=0.83。該模型與實測值能較好地擬合，可以用于綠原酸提取條件的分析和預(yù)測。各因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響大小為B>C>A，即料液比>超聲時間>乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 交互作用分析 在一個因素不變的情況下，考察其他兩個因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響。經(jīng)Design Expert 8.05b軟件分析，交互項AB、AC、BC對綠原酸提取率均有極顯著影響，所得到的響應(yīng)面及等高線圖如圖4所示。

2.2.4 最優(yōu)化條件確定 采用Design Expert 8.05b軟件預(yù)測的甘薯莖葉綠原酸提取的最優(yōu)化條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70.03%、料液比1∶20.68（g∶mL）、超聲時間24.09 min，在此條件下，綠原酸提取率為3.106 8%。為了檢驗該預(yù)測是否準(zhǔn)確，兼顧實際操作的方便，將最佳工藝條件修正為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g∶mL）、超聲時間24 min，在此條件下進行3次平行試驗，實際測得綠原酸提取率的平均值為3.097 2%，與預(yù)測值相差不大。因此，利用響應(yīng)面法優(yōu)化甘薯莖葉中綠原酸超聲提取工藝是可行的，具有良好的應(yīng)用價值。

3 小結(jié)

采用超聲輔助法從甘薯莖葉中提取綠原酸，對甘薯莖葉資源的開發(fā)利用具有較大的現(xiàn)實意義。通過響應(yīng)面法分析優(yōu)化其提取工藝，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型Y=3.10-2.500×10-3A+0.060B-0.053C-0.088AB-0.087AC+0.083BC-0.21A2-0.17B2-0.12C2。該模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測甘薯莖葉中綠原酸的提取率。

通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化確定甘薯莖葉中綠原酸提取的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%、料液比為1∶20、超聲時間24 min，在此條件下進行3次試驗，實際測得綠原酸提取率的平均值為3.097 2%，與預(yù)測值相差不大。試驗所用甘薯莖葉來源廣泛，價格低廉，采用超聲提取法提取甘薯莖葉中綠原酸具有省時、高效、清潔、提取率高的優(yōu)點。

參考文獻：

[1] 林啟壽.中草藥成分化學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1977.

[2] 羅思齊.中草藥活性成分含量測定概述[J].醫(yī)學(xué)教育探索，1989（9）：19-26.

[3] 劉軍海，裘愛泳.綠原酸及其提取純化和應(yīng)用前景[J].糧食與油脂，2003（9）：44-46.

[4] 馬建華，錢素平，林維真，等.綠原酸對脫氧鳥苷酸氧化性羥基加合物的快速修復(fù)[J].中國科學(xué)（B輯），1998，28（6）：561-565.

[5] 宣 寒，謝發(fā)之.響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花中綠原酸的超聲提取工藝[J].應(yīng)用化工，2010，39（10）：1474-1477，1501.

[6] 楊 茉，周 晶，張慶偉，等.酶法輔助提取金銀花中綠原酸的工藝研究[J].中成藥，2009，31（7）：1128-1130.

[7] 王 茜，李 智，何 琦，等.杜仲葉中綠原酸提取分離工藝條件的研究[J].離子交換與吸附，2008，24（1）：73-80.

[8] 李劍敏，衛(wèi)兵兵，陳志紅.微波強化提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究[J].應(yīng)用化工，2006，35（4）：243-245.

[9] ISLAM M S，YOSHIMOTO M， YAMAKAWA O.Distribution and physiological functions of caffeoylquinic acid derivatives in leaves of sweetpotato genotypes[J]. Journal of Food Science，2006，68（1）：111-116.

[10] 王麗萍，徐傳遠.酶-超聲波法提取紅薯莖葉中綠原酸的工藝研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（12）：2574-2575，2585.

[11] 李文芳，晏 麗，田春蓮，等.甘薯葉中綠原酸最佳提取工藝的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：245-248.