摘要：采用比色法和考馬斯亮藍(lán)法分別對(duì)新鮮葡萄葉中多酚和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定。采用滴定法、比色法分別對(duì)新疆紅地球葡萄葉片供試粉末中有機(jī)酸、皂苷及黃酮的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，新鮮葡萄葉片中多酚含量為0.37%，蛋白質(zhì)含量為1.01%。葡萄供試粉末中有機(jī)酸含量為1.59%，皂苷含量為1.11%，黃酮含量為0.50%。葡萄葉片中蛋白質(zhì)含量豐富，其他4種生物活性物質(zhì)成分含量高，可以作為一種可開發(fā)資源進(jìn)行深入研究。

關(guān)鍵詞：葡萄葉；有機(jī)酸；多酚；皂苷

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-1190-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.041

Abstract： The contents of polyphenol and protein in leaves of fresh grape were determined by colorimetry and Bradford method. The contents of organic acid， soap glucoside， flavanone in grape were detected using titration and colorimetry. The results showed that there were 0.37% polyphenol， 1.01% protein in leaves of fresh grape， and 1.11% soap-glucoside， 0.50% flavanone， 1.59% organic-acid in grape leaves. The content of protein and the other four kinds of biological active were high in the grape leaves. It can be futher studied and used as a natural source of drug.

Key words： grape leves； organic acid； polyphenol； soap glucoside

葡萄的根、果、藤均可入藥，葡萄葉有安胎、消腫、利尿的作用。在土耳其、希臘及中東一帶，葡萄葉大都作為烹飪材料，其中最有名的菜是多馬西（Dolmasi），是一種以葡萄葉包米和絞肉的菜肴。在新疆地區(qū)，生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)十三師生產(chǎn)加工出口的無核白葡萄葉片投入至中東市場后獲得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。

葡萄是新疆的主要經(jīng)濟(jì)作物，是種植面積廣的一種有生資源。截至2012年新疆葡萄種植面積達(dá)到12.56萬hm2，占全國種植面積的27%[1]。新疆葡萄品種資源豐富，有600多個(gè)品種，有一定種植面積的品種有將近20種，其中紅地球由于其優(yōu)良的口感，作為鮮食葡萄品種在新疆大面積種植，僅新疆農(nóng)五師就擁有6個(gè)紅地球葡萄種植團(tuán)[2]。葡萄的種植面積逐年增加，為了保證果實(shí)的質(zhì)量，葡萄種植期間需要多次除去植株外周葉片。以新疆北疆昌吉至石河子葡萄產(chǎn)區(qū)為例，長期以來葡萄葉資源大多用于釀酒工業(yè)和食用，而產(chǎn)生的廢棄物大多被焚燒，不但造成資源浪費(fèi)，還污染環(huán)境，造成了一定的資源損耗和經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)。對(duì)廢棄的葡萄葉的研究可以使生態(tài)資源得到有效利用。

課題組前期利用高相液相色譜法檢測到新疆紅地球葡萄葉中總茋類化合物含量為34.77 mg/kg[3]。本試驗(yàn)選取新疆秋季廢棄的紅地球葡萄葉，對(duì)其中5種活性成分（有機(jī)酸、黃酮、多酚、皂苷和蛋白質(zhì)）的含量進(jìn)行測定，對(duì)明確資源價(jià)值、評(píng)價(jià)適用性作為參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

在石河子秋季生長健壯、長勢(shì)較一致紅地球葡萄葉中，選取10月齡、大小相近的離體葡萄葉片（含葉柄），用去離子水洗凈、擦干。

沒食子酸、蘆丁、葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)品購于寶雞市辰光生物科技有限公司（純度≥98%）；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司（純度≥98%）；95%乙醇（分析純）購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

主要儀器包括UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SB-1000（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄葉中水分含量測定 采用鮮質(zhì)量法測定葡萄葉片含水量和相對(duì)含水量[4]，隨機(jī)取30片大小一致、葉齡相近的葉片，從葉基部剪下，用去離子水洗凈，擦拭掉葉片表面多余水分并稱量鮮質(zhì)量（初始鮮質(zhì)量）。經(jīng)105 ℃ 30 min 殺青后，75 ℃烘至恒質(zhì)量，稱重（干質(zhì)量）并計(jì)算其葉片含水量。

葉片含水量=（初始鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/初始鮮質(zhì)量×100%。

1.2.2 葡萄葉中有機(jī)酸的樣品制備 將離體葡萄葉置105 ℃的烘箱中烘4 h，取出冷卻，研成細(xì)粉，放干燥器中備用。精密稱取烘干至恒重的葡萄葉粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L NaOH 溶液100 mL，密塞，室溫放置0.5 h，抽濾，備用[5]。

1.2.3 葡萄葉中多酚、皂苷和黃酮的樣品制備 準(zhǔn)確稱取新鮮離體葡萄葉片20 g，按料液比1∶5（W/V）的比例用50 %乙醇超聲60 min，溫度為70 ℃，過濾，提取2次[6]。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉多酚粗提液。將離體葡萄葉片烘干、粉碎、過篩，稱取10 g粉末，按料液比1∶15（W/V）的比例用70%乙醇回流提取2 h，溫度為70 ℃[7]。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉皂苷粗提液。將離體葡萄葉片烘干、粉碎、過篩，稱取10 g粉末，按料液比1∶40（W/V）的比例用45%乙醇回流提取2 h，溫度為60 ℃[8]。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉黃酮粗提液。

1.2.4 葡萄葉中蛋白質(zhì)的樣品制備 準(zhǔn)確稱取葡萄葉片1 g，用 3 mL 0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.8）進(jìn)行勻漿抽提，于4 ℃條件下浸泡4 h，10 000 r/min離心18 min，上清液為蛋白質(zhì)粗提液[9]。

1.2.5 葡萄葉片中化學(xué)成分的定性分析 將上述5種提取液，按照常規(guī)化學(xué)成分的定性檢測方法進(jìn)行檢測。

1.2.6 葡萄葉中有機(jī)酸含量測定方法 精密吸取25 mL有機(jī)酸樣品溶液3份于250 mL三角燒瓶中，分別加入去離子水25 mL、酚酞指示劑2滴，用0.05 mol/L 鹽酸溶液進(jìn)行滴定。記錄溶液紅色褪去時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積（mL），并計(jì)算平均值。同時(shí)滴定0.05 mol/L NaOH 溶液25 mL，記錄空白溶液消耗標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積（mL） ，并計(jì)算平均值。計(jì)算葡萄葉片中有機(jī)酸的含量。

1.2.7 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 采用福林酚法[10]，精密稱取沒食子酸對(duì)照品3.00 mg，置于10 mL容量瓶中，去離子水定容，搖勻，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入1 mL福林酚試劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液，去離子水定容至10 mL。室溫避光放置90 min后，以第一管試劑作空白，進(jìn)行全波長掃描， 結(jié)果在650 nm處有最大吸收峰。于650 nm處分別測定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 葫蘆素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 比色法是測定皂苷最常用的方法，利用皂苷與一些試劑反應(yīng)后顯色，可在一定波長處進(jìn)行測量。本試驗(yàn)采用香草醛-高氯酸作為顯色劑，測定新疆紅地球葡萄葉中皂苷的含量。精密稱取3 mg葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品，定容至10 mL，去離子水定容，搖勻，得葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取葫蘆素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸溶液，于70 ℃恒溫加熱20 min，取出后冰水浴冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，以第一管試劑作空白，進(jìn)行全波長掃描， 結(jié)果在463 nm 處有最大吸收峰。于463 nm處分別測定其吸光度。以葫蘆素B濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 黃酮類物質(zhì)利用鋁離子與其3，4-二羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色來進(jìn)行測定，顯色劑選取亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液。精密稱取3 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，去離子水定容至10 mL，搖勻，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中， 加 5% NaNO2溶液0.3 mL， 放置6 min， 再加 10% Al（NO3）3溶液0.3 mL， 放置6 min， 加4% NaOH溶液4. 0 mL， 加水至刻度， 搖勻， 放置15 min， 以第一管試劑作空白，進(jìn)行全波長掃描， 結(jié)果在500 nm 處有最大吸收峰。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.10 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)?？捡R斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合， 使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色， 可在595 nm處進(jìn)行比色測定[11]。準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為1 mg/mL 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃保存待用。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中，各管補(bǔ)加0.15 mol/L 氯化鈉溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管，然后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，放置2 min，于595 nm處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.11 葡萄葉中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質(zhì)含量測定 取新疆紅地球葡萄葉多酚粗提液采用“1.2.7”法測定650 nm處吸光度，計(jì)算葡萄葉中總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 取新疆紅地球葡萄葉皂苷粗提液采用“1.2.8”法測定463 nm處吸光度，計(jì)算葡萄葉中皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取新疆紅地球葡萄葉黃酮粗提液采用“1.2.9”法測定500 nm處吸光度，計(jì)算葡萄葉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取新疆紅地球葡萄葉蛋白質(zhì)粗提液采用“1.2.10”法測定595 nm處吸光度，計(jì)算葡萄葉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.12 精密度，重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密度試驗(yàn)：精密吸取0.5 mL的4種標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按相應(yīng)方法進(jìn)行測定，計(jì)算；重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取4種標(biāo)準(zhǔn)品各5份，按上述處理方法平行操作測定，計(jì)算；穩(wěn)定性試驗(yàn)：各取4種標(biāo)準(zhǔn)品，每隔0.5 h測定吸光值，共5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄離體葉片初始鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和葡萄葉片含水量

葉片含水量指葉片中的水分占葉片總質(zhì)量的百分比。經(jīng)計(jì)算葉片中平均含水量達(dá)到77.22%，見

表1。

2.2 5種化學(xué)成分定性檢測結(jié)果

通過對(duì)葡萄葉片進(jìn)行化學(xué)成分定性檢測，表明葡萄葉片中含有有機(jī)酸、酚類、皂苷、黃酮類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，見表2。

2.3 葡萄葉中有機(jī)酸含量測定結(jié)果

新疆紅地球葡萄葉片粉末供試品中有機(jī)酸平均含量達(dá)到15.87 mg/g，根據(jù)已測葉片含水量77.22%，估算得出新鮮紅地球葡萄葉片中有機(jī)酸含量為3.62 mg/g。

2.4 線性關(guān)系考察、精密度，重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

沒食子酸、葫蘆素B、蘆丁和牛血清白蛋白4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表4所示，相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 3，表明在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均在5%以下。

2.5 葡萄葉中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質(zhì)含量

新疆紅地球葡萄葉片中多酚和蛋白質(zhì)采用新鮮葉片測定，一定程度避免其分解。經(jīng)測定，多酚含量達(dá)到3.70 mg/g，蛋白質(zhì)含量達(dá)到10.11 mg/g。

皂苷和黃酮的含量采用烘干后葡萄葉片粉末測定，排除水分干擾。皂苷含量為11.09 mg/g，黃酮含量為4.95 mg/g。根據(jù)所測含水量換算成鮮重含量，其中新鮮葉片中皂苷含量為2.52 mg/g，黃酮含量為1.13 mg/g（表5）。

2.6 葡萄葉提取液中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質(zhì)加樣回收率

各取已知含量的葡萄葉多酚、皂苷、黃酮和蛋白質(zhì)提取液，分別加入對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、葫蘆素B、蘆丁和牛血清白蛋白，在相應(yīng)測定方法下測定吸光度。計(jì)算回收率，見表6至表9。4種測定方法的回收率較好，達(dá)到了測定要求。

2.7 葡萄葉片中5種活性成分比例分布

根據(jù)所測的新疆紅地球葡萄葉片含水量，將葉片中的有機(jī)酸、皂苷和黃酮的含量換算成鮮重比例，與測得的多酚和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行比較。結(jié)果表明在測定的5種活性成分中，有機(jī)酸、蛋白質(zhì)占了絕大部分的比例，分別為48%和30%，接下來依次為多酚、皂苷、黃酮（圖1）。

3 小結(jié)與討論

葡萄中含有的有機(jī)酸、多酚及黃酮等物質(zhì)具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血脂等廣泛的生物活性。Landrault等[12]和Bavaresco[13]等發(fā)現(xiàn)葡萄葉、莖、果實(shí)中一些特殊活性的茋類物質(zhì)，具有潛在利用價(jià)值。文獻(xiàn)[14]對(duì)葡萄子組成成分及各組分含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中所含的化學(xué)成分具有很強(qiáng)的清除自由基的能力。前期工作也表明葡萄葉中含有豐富的茋類化合物，美國紅提中的白藜蘆醇含量達(dá)到3.34 μg/g，白藜蘆醇苷的含量達(dá)到23.73 μg/g[3]。

葡萄葉來源于自然，安全無害，是一種傳統(tǒng)中藥材， 可治療嘔吐、水腫、小便不利、目赤等癥[15]。新疆葡萄葉資源豐富，但是目前國內(nèi)研究報(bào)告較少。本研究對(duì)新疆紅地球葡萄葉片中5種生物活性成分進(jìn)行測定，為葡萄葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。測定結(jié)果表明，新疆紅地球葡萄葉中有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多酚、皂苷和黃酮，含量分別為0.36%、1.01%、0.37%、0.25%、0.11%。由圖1可看出測定的5種活性成分中，有機(jī)酸含量最高，這與葡萄中含有大量的蘋果酸、酒石酸和檸檬酸有關(guān)[16]。葉片中蛋白質(zhì)占1.01%，折合干重含量為3.62 mg/g，占干重比例的4.43%，與植物大豆21.04%相比較低，與禾本科水稻5.55%接近[17]。葡萄葉中蛋白含量豐富，可以作為飼料添加劑，國內(nèi)外大量飼養(yǎng)試驗(yàn)表明植物蛋白質(zhì)具有明顯的增加胴體重量、改善禽魚肉蛋等產(chǎn)品質(zhì)量、降低飼料消耗率等作用。從圖1中也可以看出葡萄葉片中皂苷、多酚和黃酮含量也十分豐富。

隨著研究不斷深入，有機(jī)酸具有的抗腫瘤、抑菌、抗血栓、抗艾滋病毒、降血脂等功效逐步被發(fā)現(xiàn)[18]，其提取成為了研究熱點(diǎn)。而葡萄葉片中有機(jī)酸含量高達(dá)3.62 mg/g，可以作為一種天然的提取分離物；本研究測定發(fā)現(xiàn)新鮮新疆紅地球葡萄葉中多酚含量為3.70 mg/g，雖然與葡萄皮渣（42.51±1.21） mg/g[6]相比含量偏低，但由于葡萄葉產(chǎn)量相對(duì)巨大、來源簡單，可以作為一種經(jīng)濟(jì)的多酚提取物資源；在對(duì)黃酮和皂苷的含量測定中，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)含量為1.13 mg/g，與已報(bào)道的吐魯番葡萄葉片黃酮含量5.33 mg/g[8]有一定差距。黃酮類物質(zhì)是存在于自然界的一大類化合物，具有良好的藥理活性，具有抗腫瘤、抗脂肪氧化、抗衰老等重要作用[19]，而葡萄葉資源可以作為新的黃酮藥源；目前國內(nèi)尚無對(duì)葡萄葉中皂苷含量進(jìn)行報(bào)道，本研究測定皂苷含量為2.52 mg/g。皂苷不僅可以作為藥材發(fā)揮降血糖、抗氧化、提高免疫力等功效，還可以作為高級(jí)化妝品和食品添加劑使用，如殺菌劑、發(fā)泡劑、抗氧化劑等使用。葡萄葉片中含有豐富的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多酚、皂苷和黃酮，其作為天然的自然資源具有廣泛的開發(fā)前景和利用價(jià)值， 值得綜合利用和開發(fā)。

本研究測定了葡萄葉片中水分及有機(jī)酸、多酚、皂苷、黃酮和蛋白質(zhì)的含量，但對(duì)于葡萄葉中其他物質(zhì)如多糖、纖維素、果膠等成分受試驗(yàn)條件所限尚未測定，所以反映的葡萄葉片成分含量還不夠全面，有待今后進(jìn)步一步研究。本研究可為今后進(jìn)一步研究葡萄葉片中成分及其綜合利用提供可借鑒的依據(jù)。

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