摘要：以果園土為菌種來源，采用平板分離法得到5種酵母菌，對其進行紫外線誘變，篩選出7株酵母菌突變株，通過測定突變株的發(fā)酵性能，從中篩選出1株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及發(fā)酵力均較好的酵母突變株N4-4，其發(fā)酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%，通過單因素和正交試驗確定該突變株的最佳發(fā)酵條件。結果表明，在30 ℃、120 r/min的培養(yǎng)條件下，突變株最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量（V∶V）。

關鍵詞：酵母菌；紫外線誘變；發(fā)酵條件

中圖分類號：TS261.1；Q93.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1664-04

酵母菌是白酒發(fā)酵過程中的一種重要微生物，白酒風味的形成與發(fā)酵過程中各種酵母菌息息相關[1]。酵母菌的主要作用是將原料糖化后的絕大部分糖類物質轉化為乙醇和二氧化碳，同時生成甘油、高級醇、酯、醛等代謝產物，直接影響著白酒的色澤、香氣及口感，決定著白酒的質量。酵母菌的發(fā)酵特性常常因菌株的不同而存在明顯的差異[2]，野生型酵母菌在工業(yè)發(fā)酵過程中不可避免地受到脅迫條件（如乙醇毒性、高溫脅迫等）的影響，最終影響到乙醇產率和白酒品質以及其經(jīng)濟效益。工業(yè)上常常采用紫外線誘變的方法，對釀酒酵母工業(yè)菌株進行改良來提高菌株對脅迫條件的耐受性[3]。本試驗采用紫外線誘變的方法對果園土中分離到的5株酵母菌進行誘變，以期篩選出發(fā)酵力較高的突變株，為提高白酒的產量和質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來源：分離自陜西省周至縣邵家堡村蘋果園土壤中。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌分離、純化和菌種保藏 酵母菌的分離、純化和菌種保藏參考文獻[4-6]。

1.2.2 不同菌株發(fā)酵性能測定 將分離得到的菌株分別制成酒曲后用常壓干燥法測定水分含量；采用酸堿滴定法測定酸度；采用碘量法測定液化酶活力；采用DNS法測定糖化酶活力；采用福林-酚法測定蛋白酶活力；采用CO2失重法測定發(fā)酵力[7，8]。

1.2.3 紫外線（UV）誘變 選取發(fā)酵性能最好的菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，130 r/min振蕩培養(yǎng)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，得到對數(shù)生長階段的釀酒酵母菌懸液[9]。再用麥芽汁液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋，使菌種的濃度達到1×106 個/mL。打開紫外燈（15 W），預照射20 min，使其功率達到穩(wěn)定。取4 mL菌懸液放入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿平放在距紫外燈30 cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，啟動磁力攪拌器，照射0、1、2、3、4、5、6 min后將菌液在黑暗中冷凍保存1～2 h，然后在紅燈下稀釋至1×10-6個/mL，并涂布平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計算菌株致死率，保存致死率在75%以上的孤立菌落[10]。

1.2.4 優(yōu)良突變株的篩選 在“1.2.3”的基礎上進行篩選，篩選方法同“1.2.2”。

1.2.5 優(yōu)良突變株最優(yōu)發(fā)酵條件篩選

1）pH試驗：將液體培養(yǎng)基的初始pH分別調至3、4、5、8、9、10，接種1%的優(yōu)良突變株。30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

2）碳源試驗：制備含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麩皮、麥芽糖、甘露糖、乳糖）的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

3）氮源試驗：制備含2%的不同氮源[蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4]的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

4）接種量試驗：制備100 mL液體培養(yǎng)基，分別接種2%、4%、6%、8%、10%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

1.2.6 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果設計正交試驗，選擇4因素3水平進行試驗，正交試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離、純化結果

經(jīng)反復分離純化篩選出5種酵母菌，其菌落形態(tài)特征見表2。

2.2 菌株發(fā)酵性能

將所篩選的5種酵母菌分別制成酒曲，測定其部分理化指標，結果見表3。由表3可知，酒曲N2、N4的水分含量均在12%～13%，酸度在1.1 mmol/100 g以上，研究表明，酸度在0.9～1.3 mmol/100 g的為一級酒曲，在0.6～0.9 mmol/100 g的為二級酒曲[6]，因此這兩種酒曲已滿足一級酒曲的要求。N4號酒曲液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力均為最高，N2號酒曲次之。而N2號酒曲發(fā)酵力最大，N4次之。綜合考慮各項指標，選擇N4號株菌作為出發(fā)菌種進行紫外線誘變。

2.3 N4號菌株的紫外線誘變致死率

由表4可知，紫外線處理對酵母菌有較強的致死作用。誘變時間越長，致死率越高。當致死率超過75%時常引起正突變[10]，因此選擇誘變3 min致死率為97.1%的這4株菌株（記為N4-1、N4-2、N4-3、N4-4），誘變4 min致死率為98.6%的2株菌株（記為N4-5、N4-6）和誘變5 min致死率為99.3%的1個菌株（記為N4-7）做進一步試驗。

2.4 突變株發(fā)酵性能比較

由表5可知，與對照相比，誘變4、5 min所得的突變株N4-5、N4-6和N4-7發(fā)酵力均有不同程度下降，呈現(xiàn)負突變。而誘變時間較短的N4-2、N4-3和N4-4 3株突變株發(fā)酵力較誘變前均有不同程度提高，其中突變株N4-4的發(fā)酵力最好，其液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%。

2.5 優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)突變株發(fā)酵力測定結果，對優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性進行分析，結果如表6所示。由表6可知，誘變后得到的優(yōu)良菌株N4-4經(jīng)3代傳遞，菌株發(fā)酵力仍保持較高水平，而且比較穩(wěn)定，說明突變株已具有穩(wěn)定的遺傳性狀。

2.6 優(yōu)良菌株N4-4的最優(yōu)發(fā)酵條件研究

2.6.1 酵母菌發(fā)酵的最適pH 由表7可知，pH對酵母菌的生長和發(fā)酵能力影響較大，pH為3～5時，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈增長趨勢；pH為5時菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最大，分別為2.6×1011 CFU/mL和0.865 g/（g·72 h），然后隨pH再增大，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈下降趨勢。

2.6.2 酵母菌最適碳源 由表8可知，N4-4酵母菌對不同糖類物質的利用能力差異較大。當碳源為葡萄糖時，菌落數(shù)和發(fā)酵力均達到最大，分別為6.5×1011 CFU/mL、0.913 g/（g·72 h）；當碳源為乳糖時，菌落數(shù)為5.3×107 CFU/mL，發(fā)酵力為0.363 g/（g·72 h），遠遠低于葡萄糖為碳源時的菌落數(shù)和發(fā)酵力。

2.6.3 酵母菌最適氮源 由表9可以看出，氮源為 （NH4）2SO4時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最佳，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.689 g/（g·72 h），因此，選擇（NH4）2SO4為酵母菌培養(yǎng)最適氮源。

2.6.4 酵母菌最適接種量 由表10可以看出，接種量為4%時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均達到最大，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.738 g/（g·72 h），當接種量大于4%時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力隨接種量的增大而降低。

2.7 正交試驗結果

由表11可知，4個因素對酵母菌N4-4發(fā)酵影響的大小次序為pH>（NH4）2SO4>葡萄糖>接種量。4個因素的最佳配比為A2B2C3D1，即葡萄糖3%、pH 5.0、接種量3%、（NH4）2SO4 3%。在此種配比的發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h后，酵母菌N4-4發(fā)酵力可達0.978 g/（g·72 h）。

3 討論

本研究通過平板分離、紫外線誘變篩選出1株糖化酶活力、液化酶活力、蛋白酶活力旺盛的酵母突變株N4-4，并通過正交試驗確定了該突變株的最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量、發(fā)酵溫度30 ℃。本研究雖然對分離的酵母菌進行了選育，使其發(fā)酵性能有了很大程度的提高，但該酵母突變株制作麩曲或大曲后，再次釀造白酒，能否提高白酒產量和品質等問題還有待進一步研究。

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