摘要：以果園土為菌種來源，采用平板分離法得到5種酵母菌，對其進行紫外線誘變，篩選出7株酵母菌突變株，通過測定突變株的發(fā)酵性能，從中篩選出1株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及發(fā)酵力均較好的酵母突變株N4-4，其發(fā)酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%，通過單因素和正交試驗確定該突變株的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在30 ℃、120 r/min的培養(yǎng)條件下，突變株最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量（V∶V）。

關(guān)鍵詞：酵母菌；紫外線誘變；發(fā)酵條件

中圖分類號：TS261.1；Q93.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1664-04

酵母菌是白酒發(fā)酵過程中的一種重要微生物，白酒風(fēng)味的形成與發(fā)酵過程中各種酵母菌息息相關(guān)[1]。酵母菌的主要作用是將原料糖化后的絕大部分糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，同時生成甘油、高級醇、酯、醛等代謝產(chǎn)物，直接影響著白酒的色澤、香氣及口感，決定著白酒的質(zhì)量。酵母菌的發(fā)酵特性常常因菌株的不同而存在明顯的差異[2]，野生型酵母菌在工業(yè)發(fā)酵過程中不可避免地受到脅迫條件（如乙醇毒性、高溫脅迫等）的影響，最終影響到乙醇產(chǎn)率和白酒品質(zhì)以及其經(jīng)濟效益。工業(yè)上常常采用紫外線誘變的方法，對釀酒酵母工業(yè)菌株進行改良來提高菌株對脅迫條件的耐受性[3]。本試驗采用紫外線誘變的方法對果園土中分離到的5株酵母菌進行誘變，以期篩選出發(fā)酵力較高的突變株，為提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來源：分離自陜西省周至縣邵家堡村蘋果園土壤中。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌分離、純化和菌種保藏 酵母菌的分離、純化和菌種保藏參考文獻[4-6]。

1.2.2 不同菌株發(fā)酵性能測定 將分離得到的菌株分別制成酒曲后用常壓干燥法測定水分含量；采用酸堿滴定法測定酸度；采用碘量法測定液化酶活力；采用DNS法測定糖化酶活力；采用福林-酚法測定蛋白酶活力；采用CO2失重法測定發(fā)酵力[7，8]。

1.2.3 紫外線（UV）誘變 選取發(fā)酵性能最好的菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，130 r/min振蕩培養(yǎng)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，得到對數(shù)生長階段的釀酒酵母菌懸液[9]。再用麥芽汁液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋，使菌種的濃度達到1×106 個/mL。打開紫外燈（15 W），預(yù)照射20 min，使其功率達到穩(wěn)定。取4 mL菌懸液放入直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿平放在距紫外燈30 cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，啟動磁力攪拌器，照射0、1、2、3、4、5、6 min后將菌液在黑暗中冷凍保存1～2 h，然后在紅燈下稀釋至1×10-6個/mL，并涂布平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，計算菌株致死率，保存致死率在75%以上的孤立菌落[10]。

1.2.4 優(yōu)良突變株的篩選 在“1.2.3”的基礎(chǔ)上進行篩選，篩選方法同“1.2.2”。

1.2.5 優(yōu)良突變株最優(yōu)發(fā)酵條件篩選

1）pH試驗：將液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至3、4、5、8、9、10，接種1%的優(yōu)良突變株。30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

2）碳源試驗：制備含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麩皮、麥芽糖、甘露糖、乳糖）的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

3）氮源試驗：制備含2%的不同氮源[蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、（NH4）2SO4]的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

4）接種量試驗：制備100 mL液體培養(yǎng)基，分別接種2%、4%、6%、8%、10%的優(yōu)良突變株，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，涂布平板，統(tǒng)計菌落數(shù)并測定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

1.2.6 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，選擇4因素3水平進行試驗，正交試驗因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離、純化結(jié)果

經(jīng)反復(fù)分離純化篩選出5種酵母菌，其菌落形態(tài)特征見表2。

2.2 菌株發(fā)酵性能

將所篩選的5種酵母菌分別制成酒曲，測定其部分理化指標(biāo)，結(jié)果見表3。由表3可知，酒曲N2、N4的水分含量均在12%～13%，酸度在1.1 mmol/100 g以上，研究表明，酸度在0.9～1.3 mmol/100 g的為一級酒曲，在0.6～0.9 mmol/100 g的為二級酒曲[6]，因此這兩種酒曲已滿足一級酒曲的要求。N4號酒曲液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力均為最高，N2號酒曲次之。而N2號酒曲發(fā)酵力最大，N4次之。綜合考慮各項指標(biāo)，選擇N4號株菌作為出發(fā)菌種進行紫外線誘變。

2.3 N4號菌株的紫外線誘變致死率

由表4可知，紫外線處理對酵母菌有較強的致死作用。誘變時間越長，致死率越高。當(dāng)致死率超過75%時常引起正突變[10]，因此選擇誘變3 min致死率為97.1%的這4株菌株（記為N4-1、N4-2、N4-3、N4-4），誘變4 min致死率為98.6%的2株菌株（記為N4-5、N4-6）和誘變5 min致死率為99.3%的1個菌株（記為N4-7）做進一步試驗。

2.4 突變株發(fā)酵性能比較

由表5可知，與對照相比，誘變4、5 min所得的突變株N4-5、N4-6和N4-7發(fā)酵力均有不同程度下降，呈現(xiàn)負(fù)突變。而誘變時間較短的N4-2、N4-3和N4-4 3株突變株發(fā)酵力較誘變前均有不同程度提高，其中突變株N4-4的發(fā)酵力最好，其液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對照菌株分別提高了6.7%、7.5%、8.1%和39.0%。

2.5 優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)突變株發(fā)酵力測定結(jié)果，對優(yōu)良菌株N4-4的遺傳穩(wěn)定性進行分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知，誘變后得到的優(yōu)良菌株N4-4經(jīng)3代傳遞，菌株發(fā)酵力仍保持較高水平，而且比較穩(wěn)定，說明突變株已具有穩(wěn)定的遺傳性狀。

2.6 優(yōu)良菌株N4-4的最優(yōu)發(fā)酵條件研究

2.6.1 酵母菌發(fā)酵的最適pH 由表7可知，pH對酵母菌的生長和發(fā)酵能力影響較大，pH為3～5時，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈增長趨勢；pH為5時菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最大，分別為2.6×1011 CFU/mL和0.865 g/（g·72 h），然后隨pH再增大，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈下降趨勢。

2.6.2 酵母菌最適碳源 由表8可知，N4-4酵母菌對不同糖類物質(zhì)的利用能力差異較大。當(dāng)碳源為葡萄糖時，菌落數(shù)和發(fā)酵力均達到最大，分別為6.5×1011 CFU/mL、0.913 g/（g·72 h）；當(dāng)碳源為乳糖時，菌落數(shù)為5.3×107 CFU/mL，發(fā)酵力為0.363 g/（g·72 h），遠遠低于葡萄糖為碳源時的菌落數(shù)和發(fā)酵力。

2.6.3 酵母菌最適氮源 由表9可以看出，氮源為 （NH4）2SO4時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最佳，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.689 g/（g·72 h），因此，選擇（NH4）2SO4為酵母菌培養(yǎng)最適氮源。

2.6.4 酵母菌最適接種量 由表10可以看出，接種量為4%時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力均達到最大，分別為2.2×1011 CFU/mL、0.738 g/（g·72 h），當(dāng)接種量大于4%時，酵母菌N4-4菌落數(shù)和發(fā)酵力隨接種量的增大而降低。

2.7 正交試驗結(jié)果

由表11可知，4個因素對酵母菌N4-4發(fā)酵影響的大小次序為pH>（NH4）2SO4>葡萄糖>接種量。4個因素的最佳配比為A2B2C3D1，即葡萄糖3%、pH 5.0、接種量3%、（NH4）2SO4 3%。在此種配比的發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h后，酵母菌N4-4發(fā)酵力可達0.978 g/（g·72 h）。

3 討論

本研究通過平板分離、紫外線誘變篩選出1株糖化酶活力、液化酶活力、蛋白酶活力旺盛的酵母突變株N4-4，并通過正交試驗確定了該突變株的最佳發(fā)酵條件為3%葡萄糖、3%（NH4）2SO4、pH 5.0、3%接種量、發(fā)酵溫度30 ℃。本研究雖然對分離的酵母菌進行了選育，使其發(fā)酵性能有了很大程度的提高，但該酵母突變株制作麩曲或大曲后，再次釀造白酒，能否提高白酒產(chǎn)量和品質(zhì)等問題還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎(chǔ)生化實驗[M].北京：高等教育出版社，1982.

[2] 楊舒雯，周志江，韓 燁，等.濃香型白酒窖泥中酵母種類的研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（5）：138-141.

[3] 徐日益，梁 磊，潘 琢，等.耐酒精酵母菌株的選育及其交叉耐受性的研究[J].釀酒科技，2007，26（10）：34-36.

[4] 郭 霞.濃香型白酒酒糟微生物分離及發(fā)酵試驗[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，22（1）：50-52.

[5] 胡文浪.釀酒酵母篩選、分離、純化、選育應(yīng)用[J].釀酒科技，2002，18（4）：33-34.

[6] 張其圣，張文學(xué)，方曉璞.新型白酒糖化發(fā)酵劑的制作工藝研究[J].中國釀造，2006，32（11）：34-37.

[7] 張水華.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

[8] 熊子書.中國名優(yōu)白酒釀造與研究[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1995.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

[10] 何國慶.食品微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.