摘要：以珍貴樹種土沉香（Aquilaria sinensis）幼莖為材料，研究土沉香啟動培養(yǎng)中外植體消毒的最適方法和芽誘導、愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基，植株不同部位的幼莖褐變率比較以及幼莖褐變程度與相關生理指標的關系。結果表明，土沉香啟動培養(yǎng)中外植體幼莖的消毒方法以75%的乙醇浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡5 min為最佳；芽誘導的培養(yǎng)基以1/2 MS+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA為最佳，誘導率為60%；愈傷組織誘導的培養(yǎng)基以MS+0.05 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA為最佳，誘導率為80%；上部幼莖和下部幼莖相比較，上部幼莖的褐化程度較低。幼莖褐變程度與相關生理指標的關系為：總酚含量越低，PPO活性越低，POD活性越高，褐變越嚴重。總酚含量下降是導致幼莖褐變的最主要原因。

關鍵詞：土沉香（Aquilaria sinensis）；啟動培養(yǎng)；消毒；芽誘導；愈傷組織誘導；褐變率；生理指標

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1742-04土沉香（Aquilaria sinensis）又稱白木香、香材等，為瑞香科常綠喬木，其樹干可分泌一種珍貴中藥——沉香。沉香是中國、日本、印度、東南亞以及中東國家傳統(tǒng)名貴藥材和天然香料。土沉香是我國生產(chǎn)沉香的惟一植物資源。長期以來，其生態(tài)環(huán)境一直遭到破壞，再加上人們掠奪式的采掘，土沉香野生資源量在不斷減少?！?000年世界自然保護聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》把土沉香列為易危植物，并指出土沉香只在云南景洪、廣東、海南、廣西等地可見，中國所特有[1]。為了更好地保護和開發(fā)利用土沉香，廣東、云南等地對土沉香組織培養(yǎng)體系進行了一些研究。如葉勤法等[2]取白木香嫩枝的葉片和莖段誘導愈傷組織，產(chǎn)生不定芽，再進行生根誘導，形成完整植株，取得了較好的結果，增值系數(shù)較高，生根率達100%；蘭芹英等[3]對白木香成熟胚的組織培養(yǎng)及植株再生進行研究，篩選出了利于叢生芽和幼苗生根的培養(yǎng)基，其中叢生芽誘導率不高，生根率達到85%；徐強興等[4]對土沉香快繁技術進行研究，利用間接生根法生根效果較好，生根率達86%，叢生芽增殖率高，且玻璃芽率低；杜勤等[5]用不同外植體、光照條件、激素對白木香愈傷組織進行了誘導，結果表明利用葉片黑暗培養(yǎng)有利于愈傷組織的形成；何旭君等[6]利用土沉香幼芽莖段進行組培快繁，篩選出了比較適合芽誘導的培養(yǎng)基及移栽基質(zhì)，移栽成活率高達82%。但土沉香的種源不同，其組織培養(yǎng)中的最適培養(yǎng)基是否有差別，本試驗以廣西種源的土沉香幼莖為材料，在進行啟動培養(yǎng)研究的基礎上，分析了植株不同部位的幼莖褐變率及其生理指標的關系，為在廣西進行土沉香組培并提高組培成活率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為廣西大學林學院苗圃實驗基地1年生土沉香實生苗，試驗于2012年12月～2014年5月間進行，地點設在廣西大學林學院組培實驗室和植物生理實驗室。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 于干旱的晴天，從苗圃基地土沉香種子苗優(yōu)選株上剪取健壯的幼嫩莖段，剪去葉片，將莖段浸泡在洗衣粉或洗潔精溶液中，用毛刷將外植體表面刷凈，再用自來水沖洗約30 min。然后將土沉香莖段用75%乙醇浸泡30 s，再利用0.1%升汞設置時間梯度對外植體幼莖進行消毒處理，獲得能夠對外植體幼莖徹底消毒但又不會致死的消毒方法。接種2周后觀察統(tǒng)計污染數(shù)和污染率。

1.2.2 啟動培養(yǎng)芽誘導 設置植物生長素NAA、2，4-D，細胞分裂素6-BA、KT等的濃度梯度培養(yǎng)基，研究不同植物激素濃度配比對土沉香莖段芽誘導率的影響。共32個培養(yǎng)基，其中19個以MS為基本培養(yǎng)基，13個以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，每個配方培養(yǎng)基均30瓶，每瓶接種1個外植體幼莖。培養(yǎng)條件為溫度25～27 ℃， 每天光照12 h， 光照度為2 000 lx，在接種后20 d進行觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.3 啟動培養(yǎng)愈傷組織誘導 設置植物生長素2，4-D、細胞分裂素6-BA的濃度梯度培養(yǎng)基，研究不同植物激素濃度配比對莖段愈傷組織誘導率的影響。共7個以MS為基本培養(yǎng)基的配方，每個配方培養(yǎng)基均30瓶，每瓶接種1個外植體幼莖。培養(yǎng)條件同芽誘導，在接種后15 d進行觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.4 啟動培養(yǎng)生理指標的測定 于2014年4月16日采集土沉香植株不同部位（苗木0～35 cm及35～70 cm）的外植體幼莖，并將其培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基中，觀察記錄褐變情況，每隔5 d進行一次生理指標的測定?？偡雍坎捎酶Ａ址语@色法測定[7]；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚法測定[8]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（Nitro blue tetrazolium chloride，NBT）比色法測定[9]；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[10]；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用紫外吸收法測定[11]。

2 結果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)外植體消毒

在對外植體表面消毒時， 一般消毒處理時間越長，污染率會降低， 但外植體的存活率也會降低。土沉香外植體接種后10 d內(nèi)發(fā)現(xiàn)真菌污染和細菌污染，0.1%升汞不同消毒時間對土沉香莖段污染率的影響見表1。由表1可知，經(jīng)0.1%升汞消毒5 min的效果最好，土沉香幼莖污染率較小，為10.0%，并且幼莖長時間保持綠色，正常生長。

2.2 啟動培養(yǎng)芽誘導

土沉香外植體接種后20 d左右長出不定芽，不同激素對土沉香芽誘導的影響見表2。由表2可知，相對于以MS為基本培養(yǎng)基的配方，以1/2MS為基本培養(yǎng)基的配方土沉香芽誘導率均較高，其中以22號處理1/2 MS+0.01 mg/L NAA +0.2 mg/L 6-BA的誘導率最高，達到60.0%，這與何旭君等[6]的沉香樹組織培養(yǎng)快速繁殖技術研究結果一致。

2.3 啟動培養(yǎng)愈傷組織誘導

土沉香外植體接種后15 d左右長出愈傷組織，不同激素配方對土沉香幼莖愈傷組織誘導的影響見表3。表3中的處理均以MS為基本培養(yǎng)基，其中以6號處理MS+0.05 mg/L 2，4-D +2.0 mg/L 6-BA的誘導率最高，達到80%，與葉勤法等[2]的研究結果不一致。

2.4 褐變情況及生理指標測定結果

2.4.1 褐變情況 接種3 d后土沉香外植體開始出現(xiàn)褐變。由圖1可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖的褐變率均逐漸增長，于5月1日結束測定時，褐變率均達到最大值，分別為72.7%和81.3%。土沉香上部幼莖與下部幼莖相比較，上部幼莖的褐化程度較低而下部幼莖的褐化程度較高。

2.4.2 總酚含量的變化 由圖2可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖總酚含量均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，即總酚含量越低，褐變越嚴重。其中4月16日上部幼莖和下部幼莖總酚含量均達到最大值，分別為0.12、0.11 mg/g。結果表明，土沉香不同部位外植體幼莖相比較，褐變越嚴重的部位，其總酚含量越低。

2.4.3 PPO活性的變化 由圖3可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖PPO活性均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，即PPO活性越低，褐變越嚴重。其中4月16日上部幼莖和下部幼莖PPO活性均達到最大值，分別為101.50、102.96 U/（min·g）（FW）；5月1日上部幼莖和下部幼莖PPO活性降到最小值，分別為32.6、35.0 U/（min·g）（FW）。試驗結果表明，土沉香不同部位外植體幼莖相比較，褐變越嚴重的部位，其PPO活性越高。

2.4.4 SOD活性的變化 由圖4可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖SOD活性均表現(xiàn)出先急速減低后緩慢上升的趨勢，其中4月16日上部幼莖和下部幼莖SOD活性均達到最大值，分別為254.21、229.59 U/g（FW）；4月26日上部幼莖和下部幼莖SOD活性均降到最小值，分別為54.50、20.02 U/g（FW）。試驗結果表明，土沉香不同部位外植體幼莖相比較，褐變越嚴重的部位，其SOD活性越低。

2.4.5 POD活性的變化 由圖5可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖POD活性均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，即POD活性越高，褐變越嚴重。其中4月16日上部幼莖和下部幼莖POD活性均為最小值，分別為24.98、14.95 U/（min·g）（FW）；5月1日上部幼莖和下部幼莖POD活性均達到最大值，分別為625.81、500.02 U/（min·g）（FW）。試驗結果表明，土沉香不同部位外植體幼莖相比較，褐變越嚴重的部位，其POD活性越低。

2.4.6 APX活性的變化 由圖6可知，隨著時間的延長，土沉香上部幼莖和下部幼莖APX活性均表現(xiàn)出先降后升的趨勢，其中4月21日上部幼莖和下部幼莖APX活性均降低到最小值，分別為36.64、33.50 U/（min·g）（FW）；5月1日上部幼莖和下部幼莖APX活性均達到最大值，分別為65.08、55.02 U/（min·g）（FW）。試驗結果表明，土沉香不同部位外植體幼莖相比較，褐變越嚴重的部位，其APX活性越低。

3 小結與討論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體的褐變是導致培養(yǎng)失敗的主要原因。外植體的褐變是多種因素綜合作用的結果，一般認為褐變與外植體的PPO活性和總酚含量關系密切[12]。本試驗結果表明，土沉香啟動培養(yǎng)中，上部幼莖和下部幼莖相比較，上部幼莖的褐化程度較低，其原因可能是苗木35 cm以上的幼莖枝條長勢較好，幼芽相對比較飽滿，有利于土沉香啟動培養(yǎng)幼芽的細胞分化，并有利于提高接種成活率。隨著時間的延長，褐變程度加劇，其總酚含量和多酚氧化酶（PPO）活性呈逐漸下降的趨勢，超氧化物歧化酶（SOD）活性表現(xiàn)出先急速減低后緩慢上升的趨勢，過氧化物酶（POD）活性表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性表現(xiàn)出先降后增的趨勢。

本研究結果表明，幼莖褐變率與相關生理指標的關系為：總酚含量越低，PPO活性越低，POD活性越高，褐變越嚴重。這與符真珠等[13]關于牡丹組培褐變與總酚含量及相關酶活性的關系研究結果不一致。

因此，在土沉香啟動培養(yǎng)中，提高總酚含量和PPO活性，降低POD活性，是一種控制試管苗褐變的有效辦法。

參考文獻：

[1] 田耀華，原慧芳，倪書邦，等.沉香屬植物研究進展[J].熱帶亞熱帶植物學報，2009，17（1）：98-104.

[2] 葉勤法，戚樹源，林立東.土沉香愈傷組織培養(yǎng)及植株再生（簡報）[J].熱帶亞熱帶植物學報，1998，6（2）：172-176.

[3] 蘭芹英，方春妍，何惠英，等.土沉香成熟胚的組織培養(yǎng)及植株再生[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2001，20（3）：231-232.

[4] 徐強興，吳妃華，周立賴.土沉香的組培快繁技術研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2006（8）：44-45.

[5] 杜 勤，王振華，劉書芬，等.白木香組織培養(yǎng)的初步研究[J].中國中藥雜志，2001，26（10）：679-681.

[6] 何旭君，蔡乙東，陳永鎮(zhèn)，等.沉香樹組織培養(yǎng)快速繁殖技術探究[J].林業(yè)建設，2006（4）：10-12.

[7] LOOMIS W D，BATTAILE J.Plant phenolic compounds and the isolation of plant enzymes[J]. Phytochemistry，1966，5（3）：423-438.

[8] 楊朝柱，馬傳喜，司紅起，等.普通小麥品種多酚氧化酶活性的變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37（11）：1713-1717.

[9] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2004.

[10] 沈文飚，徐朗萊，何茂柄，等.抗壞血酸過氧化物酶活性測定的探討[J].植物生理學通訊，1996，32（3）：203-205.

[11] 張立軍，樊金娟.植物生理學試驗教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2007.

[12] 張振霞，洪 萍.橄欖總多酚含量及多酚氧化酶活性與組培褐變的關系[J].中國農(nóng)學通報，2010，26（22）：54-57.

[13] 符真珠，陳 靜，徐盼盼，等.牡丹組培褐變與總酚含量及相關酶活性的關系[J].西北林學院學報，2011，26（6）：66-69.