摘要：以東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）果實成熟后的種子為供試材料，通過多因子交叉重復試驗對影響東北紅豆杉種胚發(fā)育的主要因素及其水平進行了探討，旨在篩選并確定調(diào)控東北紅豆杉種胚形態(tài)發(fā)育的主要因素及其適宜水平。結(jié)果表明，東北紅豆杉種胚發(fā)育的調(diào)控方法和主要因素及其水平為以飽和碳酸鈉溶液浸泡種子20～30 min除油脂后用粗沙去除部分種皮，再用1.80 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、2.20 mg/L赤霉素（GA3）和0.30 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）混合溶液浸泡36 h，將種子與河沙（1∶3）混合，進行155 d的變溫處理，變溫幅度和時間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，子葉胚完全分化率98.0%，種子發(fā)芽率95.0%以上。

關鍵詞：東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）；種胚；形態(tài)發(fā)育；調(diào)控技術(shù)；育苗

中圖分類號：S791.49 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1621-04

東北紅豆杉（Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.）又稱紫杉、赤板松，為紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木，該樹種在長白山區(qū)數(shù)量稀少，分布區(qū)域十分狹窄，僅在吉林省石湖自然保護區(qū)內(nèi)有較大的種群面積，其他區(qū)域僅有零星分布。東北紅豆杉不僅是材用植物，也是重要的藥用植物，其莖、枝、葉和根可入藥，主要成分含紫杉醇、紫杉堿、雙萜類化合物，具有抗癌功能[1]，并有抑制糖尿病及治療心臟病的功效。此外種子還可以榨油等，也可作東北及華北地區(qū)的綠化及造林樹種。目前，東北紅豆杉主要用插條扦插繁殖，種苗大多為灌木型，不適合東北紅豆杉的造林，加之人們對野生資源亂采濫挖，導致野生資源受到滅絕性威脅；種子苗均為喬木型，但種子繁殖發(fā)芽率極低，種子播種后當年不萌發(fā)，2～3年后僅極少數(shù)萌發(fā)，因此，東北紅豆杉大規(guī)模人工栽培、開發(fā)和利用受到極大限制。

研究[2-4]表明，在組織培養(yǎng)中，2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)搭配使用可誘導植物體細胞形成胚性愈傷組織，胚性愈傷組織可進一步分化出胚胎，胚胎相當于種子中的種胚，可直接發(fā)育形成完整的植株。為此，應用植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育原理對東北紅豆杉種胚發(fā)育進行激素和變溫處理同步調(diào)控的方法，以期篩選確定影響種胚發(fā)育的主要因素及其水平，從而解決東北紅豆杉種子萌發(fā)和育苗中存在的困難，為東北紅豆杉大規(guī)模人工栽培提供種子處理和育苗技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

10月上旬采集東北紅豆杉成熟果實（紫紅色），用水將種子和果肉分離后洗出成熟種子。用飽和碳酸鈉溶液浸泡種子20～30 min除油脂后，倒掉碳酸鈉溶液用清水沖洗種子3次，再用粗河沙與種子混合（2∶1）后將外種皮搓掉一部分保留薄薄一層（保障種胚對水、藥液的吸收）。然后將種子連同河沙用不同濃度的6-BA、赤霉素（GA3）和2，4-D混合溶液浸泡36 h，3種激素濃度初步控制在6-BA 1.20～1.70 mg/L、GA3 1.50～2.00 mg/L和2，4-D 0.50～1.00 mg/L，再均勻拌入河沙（使種子與河沙比達到1∶3）后裝入木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進行變溫處理，相對濕度控制在70%左右。

1.2 影響東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的主要因素及水平篩選

經(jīng)過“1.1”中方法將種子浸泡裝箱后開始變溫處理，變溫幅度和時間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，初步處理期限為50～125 d。期間每15 d取種子觀察種胚發(fā)育情況，按每100粒種子子葉胚完全分化率（即子葉胚后期）為考察對象，子葉胚完全分化率=子葉胚完全分化數(shù)/100×100%。為提高東北紅豆杉種胚子葉胚的完全分化率，采用均勻設計法設計試驗[5，6]，選用U12（124）和U8（84）均勻表，每處理100粒種子，重復3次取平均值。對照組采用同樣數(shù)量的種子用清水浸泡36 h后僅采用變溫處理（處理時間和變溫幅度同上），篩選確定影響東北紅豆杉種胚完全發(fā)育的6-BA、GA3、2，4-D和處理時間的適宜水平。

1.3 播種和苗期管理

經(jīng)過處理后的種子（子葉胚已完全分化）可直接均勻散播于做好的畦上，并用細土覆蓋，土層約為0.4 cm，再覆蓋適量腐熟落葉松松針，澆透水，等待種子發(fā)芽。種子發(fā)芽且子葉完全展開后，每隔15 d用噴壺于葉表面和背面噴施1次0.1%的磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑3%的代森錳鋅以防止根腐病。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過均勻設計法進行試驗設計，試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后摸索出影響東北紅豆杉種胚子葉胚完全發(fā)育主要因素的顯著性，在此基礎上再進一步補充試驗，篩選確定影響東北紅豆杉種胚完全分化率主要因素的適宜水平。均勻設計采用Uniform Design 3.0V軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的主要因素顯著性初步篩選

根據(jù)“1.1”和“1.2”中方法，進行12個水平的處理，同時開展1個水平的對照試驗，試驗數(shù)據(jù)（表1）經(jīng)分析處理后，可得回歸方程為Y=-12.9+25.8 X1+37.9 X2-24.3 X3+0.058 X4，顯著性水平α=0.05，復相關系數(shù)R=0.988 5，剩余標準差S=1.450 0，檢驗值F=74.76﹥臨界值F（0.05，4，7）=4.120，回歸方程具有顯著性，表明6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時間均對東北紅豆杉種胚子葉胚的發(fā)生影響顯著。計算6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時間對東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生的貢獻值和貢獻率可知，U1=160，U1/U=25.3%；U2=248，U2/U=39.3%；U3=142，U3/U=22.5%；U4=13.1，U4/U=2.07%。

2.2 6-BA、GA3、2，4-D濃度交叉配比和變溫處理時間對東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的影響

6-BA、GA3和變溫處理時間與子葉胚發(fā)生率呈正相關，而2，4-D與子葉胚發(fā)生率呈負相關，變溫處理時間對東北紅豆杉子葉胚發(fā)生率的貢獻雖小，但變溫處理時間在東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生過程中同樣起著不可缺少的作用，由此推測，6-BA和GA3質(zhì)量濃度分別高于1.70 mg/L和2.00 mg/L，2，4-D質(zhì)量濃度低于0.50 mg/L，變溫處理時間超過125 d時，東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)生率可能更高。為驗證此推測，又以6-BA質(zhì)量濃度為1.70、1.80、1.90和2.00 mg/L，GA3質(zhì)量濃度為2.00、2.10、2.20、2.30、2.40和2.50 mg/L，2，4-D質(zhì)量濃度為0.50、0.40、0.30、0.20和0.10 mg/L，變溫處理時間為125、140、155、170、185和200 d開展8個水平的補充試驗（表2），重復3次取平均值。操作過程同“1.1”和“1.2”中方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA、GA3和2，4-D質(zhì)量濃度分別為1.80、2.20、0.30 mg/L，以及變溫處理時間為155 d時，初期的東北紅豆杉種胚子葉胚（胚芽長度達1 784 μm）（圖1a）歷經(jīng)子葉胚中期（胚芽長度達2 377 μm）（圖1b）完全發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚后期（胚芽長度達2 850 μm）（圖1c），子葉胚完全分化率最高，達98.0%，比表1所列12個處理和對照的子葉胚完全分化率均高。

2.3 播種和苗期管理

按照“1.1”和“1.2”中方法處理后的種子（子葉胚已完全分化）不再經(jīng)過冷凍層積或GA3等處理可直接均勻散播于做好的畦上，并用細土覆蓋，土層約為0.4 cm，再覆蓋適量腐熟落葉松松針，澆透水，播種22 d后，東北紅豆杉種子開始發(fā)芽（圖2a、圖2b），發(fā)芽率達95.0%以上，45 d后幼苗可長至約10 cm（圖2c、圖2d），此時，每隔15 d用噴壺于葉表面和背面噴施1次0.1%的磷酸二氫鉀溶液，苗期可根據(jù)情況噴灑3%的代森錳鋅以防止根腐病。

3 小結(jié)與討論

由試驗結(jié)果可知，東北紅豆杉種子后熟的條件為：種子用飽和碳酸鈉溶液浸泡20～30 min去除油脂后，倒掉碳酸鈉溶液用清水沖洗種子3次，再用粗沙磨去大部分堅硬種皮，用1.80 mg/L的6-BA、 2.20 mg/L的GA3和0.30 mg/L的2，4-D混合溶液浸泡36 h后，添加河沙使種子與河沙（1∶3）拌均后裝入木槽中，覆蓋塑料薄膜置于室內(nèi)進行155 d的變溫處理，變溫幅度和時間：白天溫度為（23±2） ℃，處理10 h，夜間溫度為（15±2） ℃，處理14 h，子葉胚完全分化率可達98.0%。東北紅豆杉種子的子葉胚可由初期歷經(jīng)子葉胚中期最終完全發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚后期。

目前，對于果實成熟后種胚未分化完全的種子處理可分為兩個階段，第一階段為形態(tài)后熟（形態(tài)建成）階段，這類種子大多采取變溫處理促使種胚發(fā)育至可萌發(fā)的子葉胚；第二階段為生理后熟階段，即已形態(tài)后熟（可萌發(fā)的子葉胚）的種子進一步采取低溫層積或用GA3等激素浸泡后再播種萌發(fā)。但這種時間較長、單一的變溫處理控制較難，導致種胚發(fā)育緩慢、種子容易腐爛霉變，發(fā)芽率較低，這可能是單一變溫處理的種子種胚發(fā)育不徹底，可萌發(fā)的子葉胚種子較少等原因所致。

在東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育過程中，6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時間均對東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化影響顯著。通過計算可知，6-BA、GA3、2，4-D和變溫處理時間對東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化影響的貢獻率分別是25.3%、39.3%、22.5%和2.07%，說明4個因素對東北紅豆杉種胚子葉胚完全分化的貢獻大小順序為GA3、6-BA、2，4-D、變溫處理時間，6-BA、GA3和2，4-D遠大于變溫處理時間對東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育的貢獻，說明6-BA、GA3和2，4-D對種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育起主要調(diào)控作用，這可能是6-BA、GA3和2，4-D在調(diào)控過程中導致細胞產(chǎn)生一定量的乙烯類或過氧化物酶、超氧化物歧化酶及淀粉酶等酶類活性發(fā)生變化[7-10]，從而加速和促進了胚性細胞的發(fā)育進程；足夠的合理變溫處理對東北紅豆杉子葉胚形態(tài)發(fā)育起到不可缺少的輔助調(diào)控作用，可能是種胚需要適當溫變刺激才能完成乙烯類或酶類的產(chǎn)生和表達，也可能是東北紅豆杉種子在變溫處理過程中種子可溶性糖含量增加給種胚提供了利于生長的足夠碳源等物質(zhì)基礎[11，12]。

通過適當濃度的6-BA、GA3和2，4-D浸泡種子后，進行合理的變溫處理，種子不需要再進行生理后熟就可直接播種發(fā)芽，這可能是東北紅豆杉種子在處理過程中，6-BA、GA3和2，4-D的聯(lián)合作用，導致種子中積累了具有打破休眠作用的GA3，在東北紅豆杉種胚子葉胚形態(tài)發(fā)育完全后，GA3在細胞分裂素（6-BA）的協(xié)同下發(fā)揮作用，從而解除了生理休眠或完成了生理后熟，這也正是細胞分裂素具有促使物質(zhì)（GA3）起作用的“許可”作用[13]。

東北紅豆杉是中國珍貴的植物資源，因其育苗存在的難點，導致至今未得到大規(guī)模人工栽培和推廣應用，本研究解決了東北紅豆杉種胚子葉胚發(fā)育調(diào)控和育苗技術(shù)，不僅解決了種子萌發(fā)難和扦插存在生根率極低、威脅野生資源等問題，而且克服了以往報道中需要變溫處理后再進行生理后熟的復雜過程[14-16]，具有處理東北紅豆杉時間短、可操作性強、發(fā)芽率極高等優(yōu)點，屬集成一步后熟技術(shù)，可推廣應用于東北紅豆杉的工廠化育苗和規(guī)模化栽培。

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