摘要：研究了不同濃度的乙酰胺對(duì)念珠藻106（Nostoc sp. 106）在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和生長(zhǎng)末期的影響。研究結(jié)果表明加入一定濃度的乙酰胺對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)有一定的刺激作用。測(cè)定葉綠素a、藻膽蛋白含量、SOD含量、ATP含量等生長(zhǎng)代謝指標(biāo)，表明加入濃度為1、2和5 mg/mL的乙酰胺不同程度地延緩了念珠藻Nostoc sp. 106的衰亡，濃度5 mg/mL的乙酰胺增加了念珠藻Nostoc sp. 106在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間。

關(guān)鍵詞：乙酰胺；葉綠素a；藻藍(lán)蛋白；念珠藻106（Nostoc sp.106）

中圖分類號(hào)：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1699-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.043

藍(lán)藻是水生生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著重要的作用。藍(lán)藻的大量生長(zhǎng)惡化水體的通風(fēng)及光照條件、抑制水體中浮游生物有益種類的生長(zhǎng)繁殖、阻礙水中植物的光合作用，擠占其他水生生物的生存空間[1]。藍(lán)藻生命力強(qiáng)，越冬期生活在湖泊的底泥中，遇到適合其生長(zhǎng)的外部環(huán)境條件如光照、溫度、溶解氧（DO）等時(shí)，再次復(fù)蘇[2]。念珠藻作為藍(lán)藻一個(gè)代表種，屬于水華爆發(fā)中的常見(jiàn)藻種。

近年來(lái)，有許多關(guān)于湖泊富營(yíng)養(yǎng)化與藍(lán)藻爆發(fā)相互作用的報(bào)道，但就某類污染物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)影響的具體研究較少。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)工業(yè)廢水中的酰胺類物質(zhì)可能是藍(lán)藻爆發(fā)與瘋長(zhǎng)的原因之一。乙酰胺（acetamide）別名醋酰胺，是有機(jī)氟殺蟲農(nóng)藥氟乙酰胺中毒的解毒藥，可用作對(duì)水溶解度低的一些物質(zhì)在水中溶解時(shí)的增溶劑，如纖維工業(yè)中常用乙酰胺作染料的溶劑和增溶劑。因此隨著工業(yè)廢水的排放，每年有大量的乙酰胺進(jìn)入湖泊、河流等自然水體中。本研究就乙酰胺對(duì)念珠藻106（Nostoc sp.106）生長(zhǎng)周期的影響進(jìn)行了研究，對(duì)比不同濃度的乙酰胺對(duì)念珠藻106（Nostoc sp.106）在對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和生長(zhǎng)末期的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻種：念珠藻106（Nostoc sp.106）由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)（FACHB）提供。BG-11培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)Nostoc sp.106。培養(yǎng)溫度為25 ℃， 可見(jiàn)光照度2 000 lx，pH 6.8，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

乙酰胺：由成都科龍化工試劑公司提供（分析純AR）。

其余所用試劑均為分析純（AR）。

試驗(yàn)儀器：LRH-250型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、可見(jiàn)分光光度計(jì)721G（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 乙酰胺對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)周期的影響試驗(yàn)

分別將對(duì)數(shù)期的念珠藻106（Nostoc sp.106）接種于4個(gè)1 000 mL錐形瓶中，藻液接滿1 000 mL。1號(hào)為空白對(duì)照試驗(yàn)，2號(hào)加入乙酰胺濃度為1 mg/mL，3號(hào)加入乙酰胺濃度為2 mg/mL，4號(hào)加入乙酰胺濃度為5 mg/mL。每天光照10 h、曝氣24 h、磁攪拌力器攪拌，試驗(yàn)溫度25 ℃， pH 6.8，每隔24 h定點(diǎn)取樣分析。

1.3 葉綠素a（Chl a）的測(cè)定

每隔24 h定時(shí)取5 mL（定為V1）藻液于10 mL離心管中，在超聲破碎儀上破碎30 s，工作時(shí)間1 s，間隔2 s，然后在樣品中加入20 μL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的MgCO3溶液，于8 000 r/min下離心15 min，棄去上清液[3]。在沉淀中加入3 mL丙酮溶液，于4 ℃冰箱中過(guò)夜萃取18～24 h，于7 000 r/min下離心10 min，取上清液于7 mL離心管中，分別測(cè)定750，663，645 和630 nm的吸光度（OD），取7 mL離心管中上清液的體積為V2，利用下式計(jì)算Chl a （mg/mL）：

葉綠素a含量=[11.64×（OD663 nm-OD750 nm）-2.16×（OD645 nm-OD750 nm）+0.1（OD630 nm-OD750 nm）]V2/V1

1.4 藻藍(lán)蛋白（C-PC）含量的測(cè)定

參照Padula的方法[4]，在分光光度計(jì)下測(cè)量藻藍(lán)蛋白在620和650 nm的OD，用以下公式計(jì)算C-PC（mg/L）：

C-PC=（166×OD620 nm）-（108×OD650 nm）

1.5 藻密度的吸光度值

超聲破碎，用分光光度計(jì)（721G）在680 nm下測(cè)量藻液的吸光度值[5]。

1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定

于25 ℃，在4.5 mL 50 mmol/L，K2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入待測(cè)的樣品SOD粗酶液，再加入10 μL 50 mmol/L聯(lián)苯三酚，迅速搖勻，將搖勻的反應(yīng)液立即倒入光徑為1 cm的比色杯內(nèi)，分光光度計(jì)325 nm波長(zhǎng)下每隔30 s測(cè)OD一次，要求連苯三酚的自氧化速率控制在 OD0.07/min左右，對(duì)照管取10 mmol/L HCl代替[6]。

測(cè)得數(shù)據(jù)按下式計(jì)算SOD活性（U/mL）：

SOD活性=[0.07-OD325 nm/min]/0.07×100%/50%×反應(yīng)液總體積×樣液稀釋倍數(shù)/樣液體積。

1.7 ATP含量的間接測(cè)定法

采用間接測(cè)定的改進(jìn)法[7]，取20 mL藻液，在8 000 r/min下離心10～15 min，棄去上清液，沉淀用少量蒸餾水溶解（2～3 mL）。將上述沉淀溶解液加入消解罐中，再向其中加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的 濃硫酸。旋緊罐塞，在消解儀器中進(jìn)行消解，消解完畢冷卻至室溫。然后旋開(kāi)罐塞，向罐中加入1～2滴H2O2，搖勻，用蒸餾水稀釋至10 mL，此即為消化液。將上述消化液取3 mL加入25 mL的比色管中，在另一管中加3 mL蒸餾水為對(duì)照，再向兩管中均加入3 mL定磷試劑，同置于45 ℃水浴25 min。取出比色管冷至室溫，在722N型分光光度計(jì)上660 nm處比色測(cè)定OD（用OD反映ATP含量大?。?。定磷試劑的配置：按體積比例，蒸餾水2份、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的鉬酸銨1份、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的抗壞血酸1份、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.33%的硫酸1份，混合。

2 結(jié)果與討論

2.1 念珠藻106葉綠素a含量變化

葉綠素a是藍(lán)藻光合作用不可缺少的催化劑，其含量的多少直接反應(yīng)了藍(lán)藻生長(zhǎng)代謝的活性[8]（圖1）。加入乙酰胺濃度為1、2和5 mg/mL樣品的葉綠素a明顯高于空白樣。乙酰胺對(duì)念珠藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。在對(duì)數(shù)初期，加入乙酰胺藻樣和空白藻樣區(qū)別不明顯。進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，空白藻樣和乙酰胺濃度為1、2 mg/mL的藻樣葉綠素a含量基本穩(wěn)定，而乙酰胺濃度5 mg/mL的藻樣葉綠素a含量繼續(xù)保持增長(zhǎng)，仍然處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。由此可見(jiàn)，加入濃度5 mg/mL乙酰胺對(duì)念珠藻106（Nostoc sp.106）的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的刺激作用。其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期持續(xù)時(shí)間較空白樣品更長(zhǎng)，其光合作用的速率較空白樣品更高，其細(xì)胞生長(zhǎng)代謝活性較空白樣品更強(qiáng)，從而提高了藍(lán)藻水華爆發(fā)的概率。

2.2 乙酰胺對(duì)念珠藻106生長(zhǎng)速度的影響

由圖2所示，加入乙酰胺濃度1、2和5 mg/mL的樣品藻密度比空白樣高。進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，加入乙酰胺濃度1、2 mg/mL的樣品藻密度區(qū)別不明顯。而加入5 mg/mL的樣品藻密度高于空白樣品57%，表明其藍(lán)藻個(gè)體數(shù)量較空白樣品多，所能占用的水生資源與營(yíng)養(yǎng)比空白樣品多，為藍(lán)藻的大量繁殖生長(zhǎng)提供了基礎(chǔ)。

2.3 乙酰胺對(duì)念珠藻106藻藍(lán)蛋白（C-PC）含量的影響

藻藍(lán)蛋白與葉綠素a在藍(lán)藻的光合作用中起著同等重要的作用，是藻類細(xì)胞中光合作用的一部分，將補(bǔ)獲的光能傳遞給葉綠素a[9]。

由圖3所示，進(jìn)入生長(zhǎng)末期，加入乙酰胺濃度為1、2和5 mg/mL樣品的藻藍(lán)蛋白含量與對(duì)照差異顯著，而濃度5 mg/mL乙酰胺樣品藻細(xì)胞內(nèi)C-PC含量較高，體內(nèi)活性蛋白較多，表明光合作用系統(tǒng)較完整。

2.4 乙酰胺對(duì)念珠藻106 SOD含量的影響

在葉綠體中，超氧自由基的清除是通過(guò)SOD酶來(lái)催化完成的，當(dāng)這種清除體系遭到破壞時(shí)，導(dǎo)致 ·O2-積累，進(jìn)而引起H2O2積累，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，致使葉綠素含量下降，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻[10]。由圖4可見(jiàn)，在生長(zhǎng)末期正常藍(lán)藻細(xì)胞體內(nèi)的SOD含量減少了67%，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)不能保持平衡，藻細(xì)胞的死亡速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生長(zhǎng)速度。而濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣SOD含量減少了43%， 基本能夠維持抗氧化功能。

2.5 乙酰胺對(duì)念珠藻106 ATP含量的影響

ATP可以指示微生物的生物量和活性。由圖5所示，濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣在生長(zhǎng)末期ATP含量比對(duì)數(shù)期下降了70%，仍高于空白樣；而濃度1和2 mg/mL的樣品和對(duì)照樣區(qū)別不明顯。由此可見(jiàn)，濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣在生長(zhǎng)末期的細(xì)胞活性要高于對(duì)照樣，延長(zhǎng)了藍(lán)藻的生命周期。

3 結(jié)論

在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，加入濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣，藻密度、葉綠素a含量都高于同期空白樣品，乙酰胺對(duì)念珠藻106的生長(zhǎng)有正面的刺激作用，延長(zhǎng)了藍(lán)藻的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)間，提高了藍(lán)藻水華爆發(fā)的概率。

在生長(zhǎng)末期，加入濃度5 mg/mL乙酰胺的藻細(xì)胞葉綠素a、C-PC、SOD和ATP含量都高于空白樣品，表明該濃度乙酰胺間接延緩了念珠藻106的衰亡，延長(zhǎng)了藍(lán)藻正常生命周期的時(shí)間，提高了藍(lán)藻細(xì)胞的活性，增加了藍(lán)藻水華爆發(fā)的強(qiáng)度。

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