摘要：比較分離自溫泉、淡水及土壤的捕食線蟲真菌——少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）的生長特性及捕食效力。通過測定三種生境少孢節(jié)叢孢在不同溫度、pH及有氧和無氧條件下的生長率及其在最適培養(yǎng)條件下對線蟲的捕食率，得出三種生境中少孢節(jié)叢孢的最適生長溫度均為30 ℃，分離自溫泉和土壤的少孢節(jié)叢孢最適pH分別為5.5～7.0和4.5～5.5，而淡水生境少孢節(jié)叢孢對不同pH具有廣泛適應性；淡水和溫泉生境少孢節(jié)叢孢對無氧環(huán)境有一定的耐受性，而土壤生境少孢節(jié)叢孢在無氧環(huán)境下生長率低至1.24 cm/5 d。三種生境的少孢節(jié)叢孢捕食效力沒有顯著性差異。

關鍵詞：生境；少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）；生長特性；捕食效力

中圖分類號：S476.15 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1609-03

線蟲病是動植物的一大類寄生蟲病，每年給農牧業(yè)造成巨大的損失[1，2]。長期使用化學藥物對寄生蟲病進行防治，易使蟲體產生抗藥性，且化學藥物的某些有害成分排出機體后，會對環(huán)境造成污染，進而影響自然界的生態(tài)平衡；藥物殘留成分隨著畜產品和農產品——奶、蛋、肉、蔬菜、水果等進入人體，最終對人體健康造成危害。因而用捕食線蟲真菌對寄生線蟲進行生物防治，可以避免上述問題的產生，無論從經濟效益還是從社會效益來看，其發(fā)展和應用的前景都是巨大的[3]。國內外在農作物線蟲的生物防治上已有了商品化的食線蟲真菌制劑。從自然環(huán)境中篩選捕食線蟲真菌并對其生長特性及捕食效力測定是捕食線蟲真菌作為生防菌株篩選的重要環(huán)節(jié)之一，而不同生境捕食線蟲真菌的生長特性及捕食效力是否存在差異，目前還沒有相關報道。少孢節(jié)叢孢是目前研究最為全面的捕食線蟲真菌之一[4-10]。近年來，本實驗室先后從大理周邊環(huán)境分離得到不同生境的少孢節(jié)叢孢菌株，旨在比較來自溫泉、淡水和土壤的少孢節(jié)叢孢菌株在不同溫度、pH、有氧和無氧條件的生長特性及其捕食效力的差異，探討不同生境對捕食線蟲真菌適應能力的影響，研究結果可為今后生防捕食線蟲真菌的篩選和應用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 三種生境少孢節(jié)叢孢（Arthrobotrys oligospora）菌株由大理學院農學與生物科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 0.4 g/L 玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）：稱取40 g新鮮玉米粉，加入1 000 mL去離子水，微火煮沸1 h，補足水分至1 000 mL，用紗布過濾后，取濾液10 mL，加990 mL去離子水，再加入20 g瓊脂粉，經121 ℃ 30 min高壓滅菌后，傾注于直徑為60 mm的滅菌玻璃培養(yǎng)皿中備用。不同pH培養(yǎng)基配制方法同上，然后用1 mol/L NaOH和HCl分別調整pH至4.5～8.5，經121 ℃ 30 min高壓滅菌后，傾注于直徑為60 mm的滅菌玻璃培養(yǎng)皿中備用。

1.1.3 線蟲幼蟲混懸液 全齒復活線蟲（Panagrellus redivivus）由農學與生物科學學院微生物實驗室提供，制備成線蟲幼蟲混懸液（約5 000條/mL）備用。

1.2 生長率比較

1.2.1 不同溫度下生長率的比較 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培養(yǎng)7 d的3株少孢節(jié)叢孢，在培養(yǎng)基邊緣切取5 mm×5 mm的小塊，分別接種于pH 6.0～6.2的0.4 g/L CMA上，每種菌株分為9組，每組含3個培養(yǎng)基，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下培養(yǎng)，5 d后測算其生長率。

1.2.2 不同pH下生長率的比較 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培養(yǎng)7 d的3種菌株，在培養(yǎng)基邊緣切取5 mm×5 mm的小塊，接入制備好的CMA固體培養(yǎng)基中。每種菌株分為9組，分別置于pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的培養(yǎng)基中，每組含3個培養(yǎng)基，做好標記后放入30 ℃恒溫箱內培養(yǎng)7 d。接種次日開始每天定時測量1次菌落直徑，直至長滿平板。然后測算其生長率。

1.2.3 有氧和無氧條件下生長率的比較 每種菌株分為2組，每組含3個培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基和接種方法同前。接種菌絲后，分別置于30 ℃有氧和無氧條件下培養(yǎng)，5 d后分別進行生長率的測定。

1.3 三種菌株捕食線蟲效力比較

試驗共設4個組，每組3次重復。第1、2、3組分別接種三種生境少孢節(jié)叢孢菌株，第4組為對照組（無菌株）。將各組置于各自最適培養(yǎng)條件下，5 d后，每個平皿內加入幼蟲懸液1 mL（5 000 條/mL），在體視顯微鏡下檢查其活力，3 d后統(tǒng)計線蟲的死亡率。按下列公式計算出菌株捕食線蟲的效力，用百分率表示。試驗結果采用t檢驗法進行統(tǒng)計學分析。

R=X/（X+Y）×100%。其中，R為捕食率，X為被捕獲的蟲體數，Y為自由活動的蟲體數。

1.4 數據處理

測定各組捕食線蟲真菌的菌落直徑，以平均值±標準差表示。不同處理試驗結果間的差異顯著性，采用新復極差法（SSR）進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 生長率比較

2.1.1 不同溫度下生長率比較 由表1可見，三種生境的少孢節(jié)叢孢最適生長溫度為30 ℃。統(tǒng)計分析表明此溫度條件下，真菌的生長速度與其他溫度間差異顯著。

2.1.2 不同pH下生長率的比較 由表2可見，三種生境捕食線蟲真菌生長最適pH不同。方差分析表明，分離自淡水的捕食線蟲真菌在pH 5.0、5.5時，其生長率差異顯著，在pH 7.0、7.5時，真菌生長較好；分離自土壤的捕食線蟲真菌在pH 4.5～5.5之間，真菌生長較好；分離自溫泉的捕食線蟲真菌在pH 5.5～7.0之間，真菌生長較好。

2.1.3 有氧及無氧環(huán)境下生長率比較 由表3可見，淡水和溫泉生境的少孢節(jié)叢孢在有氧和無氧條件下的生長率差異不顯著（P>0.05），而土壤生境少孢節(jié)叢孢在無氧條件下的生長率下降明顯，生長率差異顯著。

2.2 三種菌株捕食率的比較

三種生境條件下菌株捕食率統(tǒng)計結果（表4）表明，在淡水、溫泉和土壤三種生境的少孢節(jié)叢孢其捕食效力差異不顯著（P>0.05），且三者與對照組相比，捕食效力均達60%以上。

3 討論

不同溫度下的生長率比較結果顯示，不同生境少孢節(jié)叢孢的最適生長溫度均為30 ℃，表明同一地區(qū)不同生境條件下的少孢節(jié)叢孢對溫度的適應性相同。楊曉野等[8]對少孢節(jié)叢孢CIMHI菌株生長溫度范圍測定為15～30 ℃，其中以20 ℃生長最好。而鄢小寧等[11]對少孢節(jié)叢孢HNQ11菌株最適生長溫度的測定值為25 ℃，說明少孢節(jié)叢孢存在地區(qū)溫度適應性的差異。提示在篩選生防捕食線蟲真菌的時候，盡量從本地區(qū)篩選，縮短菌種的適應周期，以更好更快地發(fā)揮其捕食效力。

不同pH條件下，土壤中的少孢節(jié)叢孢在pH 4.5～5.5之間，即偏酸性的條件下生長比較好；而分離自溫泉的少孢節(jié)叢孢在不同pH條件下生長速率波動較大，在pH 5.5～7.0之間的生長較好；分離自淡水的少孢節(jié)叢孢在不同pH條件下生長速率沒有明顯差異。從不同菌株的生長環(huán)境來看，出現這種情況的原因是由于土壤偏酸性[12]，長期生長在這種環(huán)境中的少孢節(jié)叢孢已經適應這種生存環(huán)境；溫泉中的少孢節(jié)叢孢采自于大理彌渡徂萊溫泉，溫泉水pH為6.8，實驗室測定的最適pH為6.5，兩者差異不大；淡水少孢節(jié)叢孢分離自洱海，洱海水質1986～1996年偏堿性[13]，隨著洱海保護效果的顯現，洱海水pH已經逐漸降低，但仍然會隨著季節(jié)變動[14]，導致分離自洱海的淡水捕食線蟲真菌具有廣泛的酸堿適應能力。

本次試驗從溫泉和淡水篩選到的少孢節(jié)叢孢對無氧環(huán)境的耐受力明顯好于土壤生境中的少孢節(jié)叢孢菌株，出現這種現象的原因可能是由于試驗所采集土樣為5～15 cm土壤，其中氧含量較高所致。試驗結果顯示，土壤生境中的捕食線蟲真菌可能不適合作為動物腸道寄生線蟲生防菌株來源（動物腸道為厭氧環(huán)境）。結合不同pH下生長率的比較結果，推測水環(huán)境中的捕食線蟲真菌對動物腸道環(huán)境適應能力更強。而一直以來，土壤被認為是微生物的天然種質資源庫，目前已經分離到的捕食線蟲真菌也絕大多數來源于土壤，因此有必要加強對水生捕食線蟲真菌資源的開發(fā)和應用研究。

三種少孢節(jié)叢孢在其最適培養(yǎng)條件下對全齒復活線蟲的捕食率測定結果分別為：溫泉63.30%，土壤62.73%，淡水61.50%，差異不顯著，這是否說明同一地區(qū)不同生境捕食線蟲真菌的捕食能力趨同，還有待對更多不同生境同種捕食線蟲真菌捕食率進行比較后方可確定。莫明和等[15]測定了少孢節(jié)叢孢對松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（Bursaphelenchus mucronatus）的捕食率，測定結果分別為31.15%和31.12%，鄢小寧等[11]發(fā)現少孢節(jié)叢孢HNQ11菌株在25 ℃條件下對松材線蟲幼蟲的捕食率高達87%，表明不同地區(qū)分離到的少孢節(jié)叢孢對同種或不同線蟲的捕食效率都存在較大差異，在生防菌株的選擇上要充分考慮到菌株的地區(qū)差異性及線蟲的種類差別。

參考文獻：

[1] 楊玉琴，楊曉野，郭媛華.捕食線蟲的真菌在家畜線蟲生物防治中的作用[J].內蒙古獸醫(yī)，1998（1）：22-24.

[2] 楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮.寄生蟲生物控制概述[A].中國動物學會第八次全國寄生蟲學學術討論會論文摘要匯編[C].呼和浩特：2001.38-41.

[3] 陳 越，杜生明.21世紀初畜牧醫(yī)學科發(fā)展展望[M].北京：中國農業(yè)大學出版社，2000.115-132.

[4] 楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等.2種捕食線蟲性真菌生長特性和捕食效力比較[J].中國獸醫(yī)學報，2004，24（4）：395-397.

[5] WALLER P J， LARSEN M. The role of nematophagous fungi in the biological control of nematode parasites of livestock[J]. Internationzl Journal for Parasitology，1993，23（4）：539-546.

[6] 孟慶玲，王為升，王俊偉，等.少孢節(jié)叢孢菌的分離鑒定及捕食線蟲活性研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（3）：189-193.

[7] 楊玉琴，楊曉野，楊蓮茹，等.少孢節(jié)叢孢菌的生長特性研究[J]. 中國獸醫(yī)科技，1998，28（10）：24-25.

[8] 楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等.捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢菌CIMH1株捕食特性研究[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，1999，7（2）：14-17.

[9] 禹旺盛，劉珍蓮，楊曉野，等.捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢理化特性研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（6）：462-465.

[10] 王 瑞.少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）捕食線蟲生化機制研究[D].呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學，2008.

[11] 鄢小寧，鄭服叢，伍素娟.松材線蟲捕食真菌——少孢節(jié)叢孢HNQ11菌株初步研究[J].熱帶作物學報，2006，27（2）：90-94.

[12] 李麗槐，代春玲.大理洱海湖濱區(qū)農田土壤pH值變化分析[J]. 現代農業(yè)科技，2013（2）：239-240，255.

[13] 楊鐘鶴.滇西高原湖泊洱海的pH研究[J].云南環(huán)境科學， 1997，16（2）：22-25.

[14] 王明義，梁小兵，鄭婭萍，等.不同季節(jié)洱海沉積物硫酸鹽還原菌類群與含量及分布變化[J].解放軍預防醫(yī)學雜志，2007，25（1）：27-30.

[15] 莫明和，周 薇，趙明蓮，等.節(jié)叢孢屬絲孢菌對松材線蟲和擬松材線蟲的捕食[J].微生物學通報，2002，29（3）：13-16.