摘要：為研究FoxA3和Hnf4α組合對原代大鼠肝細(xì)胞體外增殖的作用，構(gòu)建了FoxA3和Hnf4α基因的慢病毒載體，共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞；倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否增殖；反轉(zhuǎn)錄PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR） 檢測外源基因和肝細(xì)胞特異基因的表達(dá)情況；PAS（Periodic acid-schiff）染色和吲哚菁綠（Indocyanine green，ICG）攝取檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞功能。結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染4 d后表達(dá)綠色熒光蛋白的部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)并增殖成簇，與正常培養(yǎng)的肝細(xì)胞相比增殖能力明顯增強(qiáng)；PCR分析表明增殖的肝細(xì)胞除表達(dá)外源FoxA3和Hnf4α外，還表達(dá)肝細(xì)胞的標(biāo)志基因Alb、CK18和G6p；功能檢測結(jié)果表明增殖的肝細(xì)胞具有成熟肝細(xì)胞糖原合成和吲哚菁綠攝取的能力。以上結(jié)果表明，F(xiàn)oxA3和Hnf4α能促使體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行增殖，并維持肝細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。

關(guān)鍵詞：FoxA3；Hnf4α；大鼠肝細(xì)胞；細(xì)胞增殖

中圖分類號：Q253 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1648-04

肝細(xì)胞占總肝量的70%～80%，具有合成血清蛋白、酶和輔酶因子，儲存糖原和維生素，以及參與藥物和外源物質(zhì)代謝等功能，是肝臟生理功能的主要執(zhí)行者[1]。在體外，肝細(xì)胞可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)、生物人工肝及細(xì)胞治療的研究與臨床中[2]。因此對功能完善的肝細(xì)胞有較高的需求，盡管原代肝細(xì)胞具有較完整的肝細(xì)胞功能，但體外培養(yǎng)中難以增殖和長期維持肝細(xì)胞的功能[3]。提高肝細(xì)胞體外增殖能力是解決肝細(xì)胞來源匱乏的一個重要方向，目前實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞體外增殖的策略有：①在培養(yǎng)基中添加生長因子、激素或化學(xué)物質(zhì)[3-5]；②使用特殊的基質(zhì)或者肝細(xì)胞和其他細(xì)胞共培養(yǎng)[6-9]； ③肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因?qū)崿F(xiàn)永生化[10]。前兩種策略能較好地維持肝細(xì)胞的特異基因表達(dá)和功能，但細(xì)胞體外增殖能力有限；肝細(xì)胞永生化能使體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞獲得無限增殖的能力，主要策略有猴腎病毒40大T抗原（Simian virus 40 large T antigen，SV40T）[11]和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）[12]基因介導(dǎo)的永生化。

2011年Sekiya等[13]將肝細(xì)胞核因子組合Foxa3和Hnf4α導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞中，獲得具有體外增殖能力的肝樣細(xì)胞，這表明FoxA3和Hnf4α可能對肝細(xì)胞體外增殖有促進(jìn)作用。因此本研究旨在探討FoxA3和Hnf4α是否能促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞增殖，以期建立一種基于肝細(xì)胞特異基因作用的永生化肝細(xì)胞系，為肝細(xì)胞永生化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試驗(yàn)動物和主要試劑

人HEK293T細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP（以下簡稱pCDH） 質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pCMVΔ8.91和pVSV-G均為本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC57-FoxA3和pUC57-Hnf4α質(zhì)粒及所有引物均合成于生工生物工程有限公司；XbaI、EcoRI、質(zhì)粒小量提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification、DNA切膠回收試劑盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、PrimeSTARTM HS DNA polymerase、T4 DNA連接酶、Taq DNA polymerase均購自寶生物工程（大連）有限公司；EGTA、CaCl2、BES、Trizol均購自上海鼎國生物工程有限公司；Sprague-Dawley（SD）大鼠由河南師范大學(xué)動物中心提供，原代大鼠肝細(xì)胞從SD大鼠肝臟中分離；膠原酶、肝細(xì)胞培養(yǎng)添加劑Insulin、Transferrin，Selenium Solution（ITS-G）100×、DMEM（高糖）培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；Reverse Transcription System購自Promega公司；糖原PAS過碘酸雪夫染色試劑盒和吲哚菁綠分別購自森貝伽公司和aladdin公司。

1.2 載體構(gòu)建與鑒定

根據(jù)大鼠FoxA3（Gene ID：402691995），-Hnf4α（Gene ID：400153985，NM 022180.2）基因序列，使用Premier 5.0設(shè)計(jì)包含XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（加粗）的FoxA3和Hnf4α引物。引物序列為：FoxA3上游引物：5′-TGCTCTAGAATGCTGGGCTCAGTG-3′；FoxA3下游引物：5′-GGCCTTAAGGGATCCTACGTAAC-3′；Hnf4α上游引物：5′-TGCTCTA-GAATGGACATGGCTGAC-3′；Hnf4α下游引物：5′-GGCCTTAAGGGATCTACCGAAGG-3′。分別以pUC57-FoxA3和pUC57-Hnf4α為模板，PCR擴(kuò)增FoxA3和Hnf4α，XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切后的目的片段分別插入pCDH質(zhì)粒中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，對長出的克隆進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人HEK293細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基中，內(nèi)含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于5% CO2、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞生長至80%～90% 匯合度時進(jìn)行傳代。大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、1% ITS-G和1% 青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。

1.4 重組慢病毒包裝、濃縮及滴度測定

采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法包裝病毒：轉(zhuǎn)染前1 d接種1×106個293T細(xì)胞于75 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取20 μg目的質(zhì)粒（pCDH-FoxA3或pCDH-Hnf4α）和10 μg pCMVΔ8.91、10 μg pVSV-G用無菌雙蒸水調(diào)至450 μL，加入50 μL的2.5 mol/L CaCl2，混勻后加入500 μL的2×BES緩沖鹽溶液充分混勻，室溫放置20 min后緩慢加到培養(yǎng)293T細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。14～16 h后換液，48和72 h后收集含病毒的上清液，0.45 μm濾膜過濾，4 ℃、6 000 r/min低速離心16 h，得到濃縮的病毒顆粒[14]，分裝后-80 °C保存。病毒液按照10倍倍比稀釋后感染293細(xì)胞，2 d后觀察熒光表達(dá)情況，細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.5 原代大鼠肝細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及感染

采用Seglen等[15]的兩步膠原酶灌流法分離大鼠肝細(xì)胞：①門靜脈灌注含EGTA的D-Hanks液；②換用含0.05%膠原酶Ⅳ的Hanks液灌注。制成細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)測定細(xì)胞存活率并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板中培養(yǎng)，4 h后換液去除沒有貼壁的細(xì)胞和死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h用于轉(zhuǎn)染。稀釋FoxA3和Hnf4α病毒液，以10 MOI （multiplicity of infection）的病毒數(shù)量加入同一個肝細(xì)胞培養(yǎng)孔中，6～12 h后換液以去除病毒液。培養(yǎng)48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)率、細(xì)胞形態(tài)和增殖情況。肝細(xì)胞感染病毒后每3 d換液1次。

1.6 PCR檢測

大鼠肝細(xì)胞感染慢病毒7 d后，按照TIANGEN的基因組提取說明書提取感染細(xì)胞和正常大鼠肝細(xì)胞的基因組，PCR擴(kuò)增exo FoxA3和exo Hnf4α；采用Trizol法抽提感染細(xì)胞和正常大鼠肝細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因作為內(nèi)參檢測肝細(xì)胞特異基因Alb、CK18和G6p的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)條件：94 °C預(yù)變性3 min； 94 °C變性30 s，退火（溫度見表1）45 s，72 °C延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相并觀察。PCR引物見表1。

1.7 PAS反應(yīng)檢測

大鼠肝細(xì)胞感染慢病毒14 d后，取感染肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞涂片，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗；過碘酸水溶液作用10 min，水洗；Schiff試劑避光反應(yīng)10 min，水洗；蘇木素染色1～2 min，水洗；分化液分化1～2 min，水洗后倒置相差顯微鏡下觀察并照相。

1.8 ICG攝取檢測

大鼠肝細(xì)胞感染慢病毒14 d后，取感染肝細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，加入含1 mg/mL ICG的肝細(xì)胞培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)箱中孵育1 h，PBS洗3次，加入肝細(xì)胞培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色并照相，攝取ICG的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組慢病毒載體的鑒定和滴度測定

構(gòu)建的重組慢病毒載體pCDH-FoxA3和pCDH-Hnf4α經(jīng)XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后分別獲得1 065 bp（FoxA3）和1 398 bp（Hnf4α）的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符，表明構(gòu)建的重組慢病毒載體是正確的。經(jīng)計(jì)算濃縮后的FoxA3和Hnf4α慢病毒滴度分別為6×107 TU/mL和7.5×107 TU/mL。

2.2 重組慢病毒感染肝細(xì)胞

在含F(xiàn)oxA3和Hnf4α基因的慢病毒感染原代肝細(xì)胞4 d后，觀察到表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞中有些增殖成簇，有些迅速凋亡。與原代肝細(xì)胞相比，增殖細(xì)胞形態(tài)呈多角的上皮樣、體積變小，有較強(qiáng)的增殖能力。增殖的肝細(xì)胞在長期體外培養(yǎng)中維持穩(wěn)定的形態(tài)和較高的增殖速率（圖2）。

2.3 增殖肝細(xì)胞的PCR檢測

檢測增殖肝細(xì)胞中外源基因的表達(dá)情況：分別以增殖肝細(xì)胞的基因組和mRNA作為模板，以質(zhì)粒作為陽性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明外源基因FoxA3和Hnf4α整合到增殖肝細(xì)胞的基因組中，并能正確表達(dá)（圖3A）。RT-PCR檢測增殖細(xì)胞的肝細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示增殖的肝細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志基因Alb、CK18和G6p，GAPDH為內(nèi)參（圖3B）。

2.4 增殖肝細(xì)胞功能檢測

PAS染色后顯微鏡下可見增殖肝細(xì)胞呈紫紅色陽性反應(yīng)，同時ICG攝取試驗(yàn)表明增殖肝細(xì)胞有攝取ICG的能力（圖4）。

3 討論

目前生物人工肝和肝細(xì)胞移植作為原位肝移植的替代方案，在肝臟疾病臨床治療中取得了一定的效果。肝細(xì)胞體外難以增殖且部分功能會逐漸喪失，在數(shù)量和質(zhì)量上遠(yuǎn)不能滿足臨床需要，因此研究肝細(xì)胞體外增殖有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。FoxA3是起始肝臟發(fā)育的“先鋒因子”、能調(diào)節(jié)肝特異基因表達(dá)和維持血糖平衡[16-18]；Hnf4α參與哺乳動物肝臟發(fā)育過程中肝細(xì)胞的分化和形態(tài)形成，而且對于成體肝臟的代謝調(diào)節(jié)和功能維持是必需的[19，20]。研究表明FoxA3和Hnf4α還能調(diào)控終末分化細(xì)胞向肝樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，F(xiàn)oxa1+Hnf4α、Foxa2+Hnf4α、Foxa3+Hnf4α、Gata4+Hnf1α+Foxa3組合均能使小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞[13，21]；FOXA3 +HNF1A+HNF4A組合還能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞[22]。然而FoxA3和Hnf4α對肝細(xì)胞體外增殖的作用研究還未見報(bào)道。因此本研究通過構(gòu)建pCDH-FoxA3和pCDH-Hnf4α重組慢病毒載體并共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代大鼠肝細(xì)胞，從而探究FoxA3和Hnf4α組合對原代大鼠肝細(xì)胞體外增殖的作用。

結(jié)果表明，肝細(xì)胞感染FoxA3和Hnf4α慢病毒后增殖能力明顯增強(qiáng)，外源基因FoxA3和Hnf4α整合到增殖的肝細(xì)胞基因組中并表達(dá)，外源基因沒有被沉默，這與Sekiya等[13]的研究結(jié)果一致。RT-PCR結(jié)果還顯示增殖的肝細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異基因Alb、CK18、G6p。PAS染色和ICG攝取結(jié)果表明增殖肝細(xì)胞維持了肝細(xì)胞糖原合成和吲哚菁綠攝取的功能。以上結(jié)果證實(shí)了FoxA3和Hnf4α對原代大鼠肝細(xì)胞體外增殖的促進(jìn)效應(yīng)，并且維持肝細(xì)胞的基本生物學(xué)特征。為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為肝細(xì)胞永生化提供了新思路。與其他來源的肝樣細(xì)胞相比，本試驗(yàn)獲得的增殖肝細(xì)胞也許能避免表觀遺傳記憶。而FoxA3和Hnf4α促進(jìn)肝細(xì)胞體外增殖的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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