摘要：以煙堿為惟一碳源，從湖北省襄陽市煙草種植土壤中分離得到1株煙堿降解菌，為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）SCUEC2。在30 ℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)，煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L時(shí)，發(fā)酵10 h后煙堿降解率達(dá)到88.80%。在30 ℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，煙堿質(zhì)量濃度為6.00 g/L時(shí)，煙堿降解率為82.59%；煙堿質(zhì)量濃度為7.00 g/L時(shí)，煙堿降解率和菌株生長呈下降趨勢，煙堿降解率為18.94%。SCUEC2菌株發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測，結(jié)果顯示，煙堿的保留時(shí)間為5.25 min左右，在培養(yǎng)到16 h時(shí)，煙堿峰峰面積明顯減小，并在保留時(shí)間為11.79 min左右處出現(xiàn)一個(gè)新色譜峰，表明有中間代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：煙堿；生物降解；蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）；降解特性

中圖分類號：Q939.11+2；S572；S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1586-04

收稿日期：2014-12-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31070087；30570046）；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2011CDA079）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練

資助項(xiàng)目（GCX12012）；湖北省煙草公司面上資助項(xiàng)目（0710XYYC2012-01）

作者簡介：李 陽（1988-），男，遼寧朝陽人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)，（電話）15172438494（電子信箱）liyang08112019@163.com；

通信作者，李曉華（1968-），教授，主要從事微生物學(xué)研究，（電話）027-67843541（電子信箱）lixiaohua@mail.scuec.edu.cn。

煙堿俗稱尼古?。╪icotine），是煙草中的主要生物堿。煙堿對人體有害，很容易被人體吸收，是吸煙上癮的主要物質(zhì)，會(huì)引起人體的心血管疾病[1]。煙堿易溶于水，在煙草種植和香煙生產(chǎn)上很容易造成固體和液體的高濃度污染，嚴(yán)重污染環(huán)境和威脅人類健康。歐盟已將每千克煙堿含量超過500 mg的煙草廢棄物規(guī)定為“有毒有害物”，其他一些國家也規(guī)定了各自相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[2，3]。因此，煙堿降解成為迫切需要解決的問題，而利用微生物降解煙堿是一種低成本、高效率且對環(huán)境影響小的方法[4]。近年來，微生物降解煙堿的研究受到關(guān)注，降解煙堿的微生物主要有嗜煙堿節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotinovorans）[5-8]、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[3，9-13]、中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）[1，14]、土壤桿菌屬（Agrobacterium sp.）[15-17]、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）[18]、米曲霉（Aspergillus oryzae）[19]等。本研究從湖北省襄陽市煙草種植地土壤分離出1株新菌株蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii），具有較高的降解煙堿性能，通過對其降解性能進(jìn)行研究， 旨在為降低煙葉和煙廠廢棄物中煙堿含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 土壤樣品采自湖北省襄陽市煙草種植地土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 煙堿培養(yǎng)基：13.30 g K2HPO4，4.00 g KH2PO4，0.10 g（NH4）2SO4，1.00 g酵母粉，10.00 mL微量元素（1.00 g MgSO4·7H2O，0.40 g MnSO4·H2O，0.20 g CaCl2·2H2O，0.20 g CuCl2·2H2O，0.02 g FeSO4·7H2O，用0.10 mol/L HCl溶液溶解定容至0.10 L），用去離子水定容至1.00 L，自然pH。高壓蒸汽滅菌后，加入一定量煙堿（用0.22 μm濾膜過濾）。煙堿分離培養(yǎng)基：煙堿培養(yǎng)基中加入1.8%的瓊脂。種子培養(yǎng)基：10.00 g胰蛋白胨，5.00 g酵母浸粉，10.00 g NaCl，先溶于0.90 L去離子水，用5.00 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.00，再用去離子水定容至1.00 L。培養(yǎng)基121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器 煙堿（純度≥98%） 購自洛陽天科生物工程有限公司；UV-6100PC紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；UltiMate3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；HZ-9211K空氣恒溫振蕩器（太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CR22G高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）。

1.2 煙堿降解菌的分離

稱取2.00 g土壤樣品于20.00 mL煙堿培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。用0.90%生理鹽水梯度稀釋，涂布于煙堿分離培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)，挑取菌株劃線分離純化。分別將純化的菌株接入煙堿培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，測定發(fā)酵液中煙堿質(zhì)量濃度。

1.3 煙堿培養(yǎng)基中煙堿質(zhì)量濃度的測定

將菌株接入煙堿培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，用不接菌的煙堿培養(yǎng)基作空白對照（CK）。發(fā)酵液在12 000 r/min條件下離心5 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀釋到合適的吸光值范圍。以0.05 mol/L HCl 溶液作參比，測定發(fā)酵液在紫外光波長為259 nm處的吸光值。煙堿降解率的計(jì)算公式為：

煙堿降解率=（原培養(yǎng)液中煙堿質(zhì)量濃度-發(fā)酵液中煙堿質(zhì)量濃度）/原培養(yǎng)液中煙堿質(zhì)量濃度×100%

1.4 菌體生長量的測定

將菌株接種至煙堿培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，定時(shí)取樣，采用分光光度法測定菌體的生長量和煙堿降解率，菌體生長量用D600 nm表示。

1.5 靜止細(xì)胞的制備

將菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在生長對數(shù)期轉(zhuǎn)接到含有煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L的煙堿培養(yǎng)基中，生長對數(shù)期離心菌體并用pH 7.00的0.05 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液洗3次備用[12]。

1.6 發(fā)酵液的HPLC檢測

用0.22 μm的水相膜過濾發(fā)酵液，HPLC檢測，檢測條件為：波長為259 nm，色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（色譜純）∶1 mmol/L H2SO4=25∶75（V/V），流速為0.50 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20.00 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙堿降解菌的分離與煙堿的測定

用0.05 mol/L的HCl溶液將純煙堿配制成濃度為5.00 g/L的工作液，分別取工作液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06 mL，用0.05 mol/L HCl溶液定容至10.00 mL，以0.05 mol/L HCl溶液為參比，測定不同濃度煙堿溶液在259 nm處的吸光值。結(jié)果顯示，煙堿濃度在0.005～0.030 g/L范圍內(nèi)時(shí)，吸光值（y）與煙堿濃度（x）呈正相關(guān)，線性回歸方程為y=35.014 29 x+0.000 07，r=0.999 95。

將煙堿降解菌SCUEC2菌株以5%的接種量接種至煙堿培養(yǎng)基，煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)10 h，進(jìn)行降解煙堿能力的測定，結(jié)果（圖1）顯示，未接種的煙堿培養(yǎng)基（CK）在259 nm處有吸收峰，而經(jīng)SCUEC2菌株培養(yǎng)10 h后，259 nm處吸收峰降低，表明SCUEC2菌株具有煙堿降解能力。

2.2 煙堿降解菌SCUEC2菌株的煙堿降解率與生長量的關(guān)系

將煙堿降解菌SCUEC2菌株以5%的接種量接種至煙堿培養(yǎng)基中，煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，取樣測定并計(jì)算發(fā)酵液的煙堿質(zhì)量濃度和菌體濃度。結(jié)果（圖2）顯示，隨著SCUEC2菌株的生長，煙堿不斷被降解，10 h后 SCUEC2菌株生長量達(dá)到最大，此時(shí)降解率達(dá)88.80%，表明煙堿降解率和菌體生長量呈正相關(guān)。

2.3 煙堿降解菌SCUEC2菌株對煙堿的耐受性

將煙堿降解菌SCUEC2菌株以5%的接種量接種至煙堿培養(yǎng)基中，煙堿質(zhì)量濃度分別為5.00、6.00和7.00 g/L，在30 ℃下、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取樣測定并計(jì)算發(fā)酵液的煙堿降解率和菌體濃度。結(jié)果（表1）顯示，煙堿質(zhì)量濃度為5.00 g/L時(shí)，煙堿降解率為80.84%；煙堿質(zhì)量濃度為6.00 g/L時(shí)，煙堿降解率為82.59%；煙堿質(zhì)量濃度7.00 g/L時(shí)菌株生長被抑制，煙堿降解率呈下降趨勢，煙堿降解率為18.94%。

2.4 溫度對煙堿降解菌SCUEC2菌株煙堿降解率和菌體生長量的影響

將煙堿降解菌SCUEC2菌株以5%的接種量接種至煙堿培養(yǎng)基中，煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L，分別在20、25、30、37和42 ℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，取樣測定并計(jì)算發(fā)酵液的煙堿降解率和菌體濃度，結(jié)果（表2）顯示，溫度為30 ℃時(shí)，煙堿降解率和菌體生長量最大；當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，煙堿降解率和菌體生長量隨溫度的升高而增大，但影響較?。划?dāng)溫度大于37 ℃時(shí)，菌株的生長受到抑制，煙堿降解率和菌體生長量隨溫度的升高呈快速下降的趨勢。

2.5 煙堿降解菌SCUEC2菌株中間代謝產(chǎn)物HPLC分析

將煙堿降解菌SCUEC2菌株的靜止細(xì)胞（D600 nm為0.60左右）以10%的接種量接種至pH 7.00、煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L的0.05 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣，發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的水相膜過濾，進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果（圖3）顯示，液體培養(yǎng)基中煙堿的保留時(shí)間在5.25 min左右。當(dāng)培養(yǎng)到16 h時(shí)，5.25 min左右的煙堿峰面積明顯減少，出現(xiàn)一個(gè)保留時(shí)間在11.79 min左右的新色譜峰，表明培養(yǎng)基中的煙堿被降解，同時(shí)產(chǎn)生中間代謝產(chǎn)物。

3 小結(jié)與討論

本研究從湖北省襄陽市煙草種植地土壤中分離得到1株煙堿降解菌，為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）。在30 ℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)接種量為5%，煙堿質(zhì)量濃度為1.00 g/L時(shí)，發(fā)酵10 h后煙堿降解率達(dá)到88.80%。在30 ℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，當(dāng)接種量為5%，煙堿質(zhì)量濃度為6.00 g/L時(shí)，煙堿降解率為82.59%；煙堿質(zhì)量濃度為7.00 g/L時(shí)，煙堿降解率和菌株生長呈下降趨勢，煙堿降解率為18.94%。煙堿降解菌SCUEC2菌株最適生長溫度為30 ℃并對高溫較敏感，當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，菌株生長受到一定的抑制。

煙堿的毒性很高，目前國內(nèi)外報(bào)道的降解煙堿微生物主要有煙草節(jié)桿菌、嗜煙堿節(jié)桿菌、氧化節(jié)桿菌、纖維單胞菌屬、棒桿菌屬、陰溝腸桿菌、煙草微球菌、假單胞桿菌、惡臭假單胞桿菌、中間蒼白桿菌屬等。本研究從湖北省襄陽市煙草種植地中分離得到煙堿降解菌SCUEC2菌株，該菌株具有高煙堿耐受力和高煙堿降解力，為利用生物技術(shù)降解煙堿廢棄物和降低煙葉中煙堿含量奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YUAN Y J， LU Z X， HUANG L J， et al. Optimization of a medium for enhancing nicotine biodegradation by Ochrobactrum intermedium DN2 [J]. Journal of Applied Microbiology， 2006， 101（3）：691-697.

[2] RAMAN G， MOHAN K， MANOHAR V， et al. Biodegradation of nicotine by a novel nicotine-degrading bacterium，Pseudomonas plecoglossicida TND35 and its new biotransformation intermediates[J]. Biodegradation， 2014，25（1）：95-107.

[3] RUAN A D， MIN H， PENG X H， et al. Isolation and characterization of Pseudomonas sp. strain HF-1， capable of degrading nicotine[J]. Research in Microbiology， 2005， 156（5-6）：700-706.

[4] LIU Y H， WANG L J， HUANG K M， et al. Physiological and biochemical characterization of a novel nicotine-degrading bacterium Pseudomonas geniculata N1[J]. PloS One，2014，9（1）： e84399.

[5] BAITSCH D， SANDU C， BRANDSCH R， et al. Gene cluster on pAO1 of Arthrobacter nicotinovorans involved in degradation of the plant alkaloid nicotine： Cloning， purification， and characterization of 2，6-dihydroxypyridine 3-hydroxylase[J]. Journal of Bacteriology，2001，183（18）：5262-5267.

[6] IGLOI G L， BRANDSCH R. Sequence of the 165-kilobase catabolic plasmid pAO1 from Arthrobacter nicotinovorans and identification of a pAO1-dependent nicotine uptake system[J]. Journal of Bacteriology，2003，185（6）：1976-1986.

[7] MIHASAN M， BRANDSCH R. pAO1 of Arthrobacter nicotinovorans and the spread of catabolic traits by horizontal gene transfer in gram-positive soil bacteria[J]. Journal of Molecular Evolution， 2013，77（1-2）：22-30.

[8] 孔 雯，先 鋒，李長影，等.1株煙堿降解菌的篩選、鑒定及其降解性能的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：30-33.

[9] TANG H Z， WANG L J， MENG X Z， et al. Novel nicotine oxidoreductase-encoding gene involved in nicotine degradation by Pseudomonas putida strain S16[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（3）： 772-778.

[10] TANG H Z， WANG S N， MA L Y， et al. A novel gene， encoding 6-hydroxy-3-succinoylpyridine hydroxylase，involved in nicotine degradation by Pseudomonas putida strain S16[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（5）：1567-1574.

[11] WANG L J， TANG H Z， YU H， et al. An unusual repressor controls the expression of a crucial nicotine-degrading gene cluster in Pseudomonas putida S16[J]. Molecular Microbiology， 2014， 91（6）： 1252-1269.

[12] WANG S N，LIU Z， TANG H Z， et al. Characterization of environmentally friendly nicotine degradation by Pseudomonas putida biotype A strain S16[J]. Microbiology，2007，153（5）：1556-1565.

[13] 翟貴發(fā)，陳素卉，李 涵，等.煙堿降解菌CW6菌株的分離鑒定及其降解特性[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013， 47（5）：676-680.

[14] 李曉華，楊曉潼，翟貴發(fā)，等.煙堿降解菌DAB2菌株的篩選、鑒定和降解特性[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013， 32（3）：18-21.

[15] WANG S N， HUANG H Y， XIE K B， et al. Identification of nicotine biotransformation intermediates by Agrobacterium tumefaciens strain S33 suggests a novel nicotine degradation pathway[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2012， 95（6）： 1567-1578.

[16] WANG S N， LIU Z， XU P. Biodegradation of nicotine by a newly isolated Agrobacterium sp. strain S33[J]. Journal of Applied Microbiology，2009，107（3）：838-847.

[17] 孔 雯.煙堿降解菌的分離鑒定、降解特性及其降解途徑的初步研究[D].武漢：中南民族大學(xué)，2011.

[18] GONG X W， YANG J K， DUAN Y Q， et al. Isolation and characterization of Rhodococcus sp. Y22 and its potential application to tobacco processing[J]. Research in Microbiology， 2009，160（3）：200-204.

[19] MENG X J， LU L L， GU G F， et al. A novel pathway for nicotine degradation by Aspergillus oryzae 112822 isolated from tobacco leaves[J]. Research in Microbiology， 2010， 161（7）： 626-633.