（湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100）

摘要：通過對斑馬魚肌肉注射不同濃度毒死蜱以及維生素E，研究斑馬魚血清中過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力變化情況以及維生素E的抗氧化作用。試驗分為5組，依次為對照組和低、中、高濃度毒死蜱組（0.002、0.02、0.2 mg/kg）以及高濃度聯(lián)合維生素E（0.2 mg/kg+VE）治療組。結果表明，毒死蜱不同濃度組短時間（24 h）作用均使兩種酶活性升高（P﹤0.01），加維生素E組活性增高更顯著；長時間（168 h）作用則明顯抑制酶活性（P﹤0.01），維生素E組酶活性變化較平緩。表明毒死蜱對斑馬魚機體抗氧化系統(tǒng)損傷作用明顯，維生素E對CAT和SOD活力有保護作用。

關鍵詞：維生素E；毒死蜱；斑馬魚；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶

中圖分類號：X592 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1590-03

毒死蜱（Chlorpyrifos）商品名為樂斯本，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，憑借其高效、低毒、廣譜的特性成為全球應用最為廣泛的農(nóng)藥之一[1]。毒死蜱主要通過干擾膽堿酯酶的活性，從而影響人類和昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。毒死蜱類有機磷農(nóng)藥對哺乳動物的毒性較低，但對水生魚類的毒性卻比較高，若使用不當進入水環(huán)境，將對水生生態(tài)和水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來比較大的危害[3]。由于毒死蜱的大量使用，在較多地區(qū)的土壤、大氣、雨水和地下水等均能檢測到毒死蜱殘留，水體也由于毒死蜱污染累積導致魚類死亡。農(nóng)藥對環(huán)境產(chǎn)生的危害最終會通過富集濃縮和食物鏈傳遞給人類[4]。因此，研究毒死蜱的毒理作用將可為農(nóng)藥安全使用，水產(chǎn)資源和生態(tài)環(huán)境保護提供理論依據(jù)。

外源毒物通過各種途徑進入生物機體后，感染機體會出現(xiàn)各種生物標記物的改變，這種生物標記物常用來評估受試化學品對生物的生態(tài)毒理效應[5]，過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）是生物標記物中最典型的兩種酶。CAT和SOD是體內(nèi)清除自由基的抗氧化酶，它們之間通過協(xié)同作用能夠防止自由基對細胞結構的損傷[6]。環(huán)境污染物質(zhì)對水生生物會造成過氧化脅迫，使生物體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基[7]，SOD能催化歧化體內(nèi)超氧陰離子自由基為過氧化氫（H2O2），CAT催化H2O2分解為H2O和O2。通過CAT和SOD調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧自由基處于平衡的狀態(tài)，一旦機體受到毒理損傷，這種平衡就會被打破，因而CAT和SOD作為抗氧化防御系統(tǒng)的改變就能反映環(huán)境對機體的毒害作用。本試驗研究了毒死蜱對斑馬魚血清中CAT和SOD的影響，以衡量農(nóng)藥對水產(chǎn)環(huán)境及水生生物的生態(tài)毒理指標。

維生素E有許多生理功能，其中最重要的功能就是抗氧化。維生素E能有效防止機體脂質(zhì)過氧化及由于外因所致的氧化，保護細胞骨架、蛋白質(zhì)巰基，維持細胞膜的正常功能，尤其是保護亞細胞膜的完整性，避免受到過氧化物損害[8]。另外維生素E還能防治由氧化應激導致的心血管疾病、動脈粥樣硬化和癌癥等[9]。本研究表明維生素E能夠有效保護CAT和SOD在斑馬魚血清中的活性，減輕毒死蜱對機體造成的過氧化脅迫。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚由中國科學院水生生物研究所提供，平均體長2～3 cm。試驗前在室內(nèi)馴養(yǎng)7 d以上，自然死亡率小于2%，試驗前1天停止喂食，試驗期間每48 h定量喂食1次。

1.2 試劑與儀器

毒死蜱原藥（98%，安徽華星化工股份有限公司），用無菌生理鹽水配成不同濃度溶液待用。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器為UV-2550型紫外-可見分光光度計（島津制作所）。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計和染毒 試驗共分5組，分別為陰性對照組、低中高3個濃度梯度試驗組和1個高濃度聯(lián)合維生素E組。根據(jù)急性毒性試驗結果，以0.002、0.02、0.2 mg/kg劑量對斑馬魚進行肌肉注射，每組25尾魚，每尾注射1 mL毒死蜱溶液，分別于容積10 L塑料箱中裝水飼養(yǎng)。維生素E劑量為100 mg/kg，稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用，使用時在旋渦混懸儀上充分混勻。試驗用水為曝氣去氯處理24 h后的自來水，水溫17～20 ℃，pH為6.8～7.5，水中溶氧量保證5 mg/L以上。按預定時間段0、24、48、96、168 h時分別取魚采樣進行分析，每組濃度每次取樣5尾。

1.3.2 取血采樣 采樣之前，先用1%肝素鈉處理注射器，于魚尾采血，直接放入干凈試管中以制備血清，對血清CAT和SOD活性進行測定。

1.3.3 酶活力測定方法 CAT活性測定采用Góth[10]的方法，以H2O2為底物，經(jīng)CAT在37 ℃催化反應1 min后，用鉬酸銨終止反應，在25 ℃放置5 min，由于反應后剩余的過氧化氫能與鉬酸銨形成穩(wěn)定的黃色復合物，其顏色的深淺與酶活力成反比，因此在405 nm處測量該黃色復合物的生成量，即可計算出CAT的活力。

SOD活性測定采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化抑制法[11]。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，生成一系列有強烈光吸收的中間產(chǎn)物，并同時釋放出O2-，該反應生成的中間產(chǎn)物在紫外320 nm處的光吸收值在最初5 min內(nèi)呈線性關系，而SOD是專以氧自由基為底物的金屬酶，在有質(zhì)子的介質(zhì)中，它能迅速將O2-歧化，產(chǎn)生O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物積累，據(jù)此原理可用來測定SOD的活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析（ANOVA），然后使用LSD檢驗比較兩組間均數(shù)的差異性。統(tǒng)計檢驗水準ɑ=0.05。

2 結果與分析

2.1 毒死蜱對斑馬魚血清CAT的影響以及維生素E對CAT的保護作用

毒死蜱對斑馬魚血清CAT的影響如圖1所示。各濃度組在24 h時對CAT活性都有激活效應，在48 h時達到最大（P﹤0.05），中濃度產(chǎn)生的激活效應最明顯（P﹤0.01）。48 h后各濃度組CAT活性都有不同程度的下降（P﹤0.05），且都比24 h時活力低。168 h后，中高濃度組CAT活力基本喪失（P﹤0.01）。

維生素E對CAT活性的保護作用如圖1所示。在96 h時，加了維生素E組的CAT活性與高濃度組相比要高一些（P﹤0.05），168 h時高濃度組CAT活力基本喪失（P﹤0.01），而維生素E組CAT活性基本和96 h一樣，并且接近對照組。表明維生素E可以維持機體CAT活性為正常水平。

2.2 毒死蜱對斑馬魚血清SOD的影響以及維生素E對SOD的保護作用

毒死蜱對斑馬魚血清SOD的影響如圖2所示。同CAT活性變化相似，各濃度組在24 h時對SOD活性都有不同程度的激活作用（P﹤0.05），在48 h時達到最大（P﹤0.01），相比之下維生素E組產(chǎn)生的激活效應最明顯（P﹤0.01）。48 h后各濃度組SOD活性都有不同程度的下降（P﹤0.05），且都比24 h時活力低，其中高濃度組下降程度最明顯（P﹤0.01）。

維生素E對SOD活性的保護作用如圖2所示。在96 h時，加了維生素E組的SOD活性與高濃度組相比酶活要高一些（P﹤0.05），168 h時高濃度組SOD活力喪失明顯，而維生素E組SOD活性維持較高水平（P﹤0.05），并且接近96 h。說明維生素E可以維持機體SOD活性。

3 小結與討論

在正常情況下，機體內(nèi)的氧自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)，此時氧自由基對機體是無害的。一旦氧自由基過量，超過了細胞抗氧化防護的能力，就會造成氧化脅迫，進而影響機體正常生理活動，容易引起癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化以及各種神經(jīng)退行性疾病[12]。毒死蜱同其他有機磷類農(nóng)藥一樣，會對生物體造成氧化脅迫，破壞氧自由基的代謝平衡，造成機體損傷[13]。機體內(nèi)部的各種組織和器官具有不同的代謝活力和耗氧量，它們抗氧化的能力也各不相同。農(nóng)藥對機體的傷害是漸進式的，首先是在血液中沉積，通過血液流到機體各個器官，造成器官代謝障礙，進而反饋影響血液中的代謝產(chǎn)物和合成產(chǎn)物發(fā)生紊亂[5]。所以，通過檢測血液中生物標記物的改變，可以更直觀地觀察待檢樣品對機體過氧化損傷的情況。這種漸進式的中毒機制也導致了不同注射濃度和作用時間對機體產(chǎn)生的毒性效應出現(xiàn)差異。CAT和SOD是體內(nèi)清除自由基的主要抗氧化酶，它們的活性很容易被體內(nèi)氧化脅迫影響，所以檢測它們的酶活性就可以反映機體受到氧化損傷的程度。

在低濃度毒死蜱脅迫下，斑馬魚血清中的CAT活性顯著升高；隨著毒死蜱濃度的升高，酶活性又進而降低，這種現(xiàn)象即為“毒物興奮效應”[14]。由于在機體內(nèi)，CAT和SOD是協(xié)同作用清除氧自由基，因此對農(nóng)藥脅迫的反應應該有相似的結果，這與試驗所觀察到的現(xiàn)象一致，兩種酶的活性均先升高然后隨著作用時間的延長而逐漸降低。在高濃度（0.2 mg/kg）毒死蜱脅迫下，SOD活性升高幅度很小，幾乎沒有激活效應，而是直接下降，說明當受到重度逆境脅迫時，SOD活性一般會降低。

維生素E在消除過氧化物，防止脂質(zhì)過氧化方面作用顯著，能清除體內(nèi)的氧化應激物對機體抗氧化酶系的氧化脅迫，從而保護抗氧化酶，使其活性維持正常。試驗中也觀察到，維生素E對CAT和SOD有明顯的保護作用，在毒死蜱脅迫96 h以后，維生素E使CAT和SOD活性與高濃度組相比維持一個較高水平。維生素E對抗氧化酶的保護作用可能是通過降低過氧化脂質(zhì)水平，提高機體還原性谷胱甘肽含量，顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性，從而維持機體內(nèi)CAT和SOD的正常水平[15]。

本試驗采用肌肉注射法施毒，具有劑量準確、藥效迅速的優(yōu)點，同時可避免體腔注射對魚體作用過于強烈和靜水投毒無法精確掌握魚體中毒量的缺陷。試驗證明肌肉注射施毒可以作為毒理學研究的有效方法。本研究結果表明，毒死蜱對斑馬魚抗氧化系統(tǒng)有明顯損傷作用，在日常的使用中應該注意施藥濃度，以免危害水資源和水生生物。對已經(jīng)遭到毒死蜱污染的生物可以嘗試用維生素E來減輕機體傷害。

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