摘要：采用平板稀釋法和平板對峙試驗，從武漢、荊州、宜昌和荊門等地的辣椒根際土壤中分離到185株細菌，篩選到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生防菌Bs04。通過形態(tài)學觀察、生理生化指標測定、16S rDNA序列測定及進化樹構建，確定菌株Bs04為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。Bs04對辣椒疫霉菌絲生長抑制率達80%，同時對煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotiana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sb. vesinfectum）和黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）具有明顯的抑制作用。利用光學顯微鏡觀察Bs04對辣椒疫霉菌絲形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)菌絲分支增多、頂端畸形、原生質濃縮及生長緩慢等現(xiàn)象，表明Bs04具有顯著的抑菌作用。

關鍵詞：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）；生防菌；鑒定；抑菌機理

中圖分類號：S436 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1596-04

辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起，是重要的辣椒根莖病害之一，在中國及世界其他國家辣椒生產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴重，給辣椒生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。對于辣椒疫病的防治大多采用化學防治，而大量使用化學藥劑導致了環(huán)境的嚴重污染，對消費者的身體健康產(chǎn)生了不利影響。目前，由于辣椒抗疫病品種較少，且多為中抗或不耐病品種，難以有效地控制辣椒疫病。因此，尋找安全有效的防治措施成為控制辣椒疫病的一個亟待解決的問題。

植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代謝產(chǎn)物對植物病害進行有效防治的技術與方法，具有無毒、無害、無污染和高效等優(yōu)點，受到了研究者的青睞。關于辣椒疫病的生物防治國內外均有相關研究報道[1-4]，但主要集中在生防菌的防效和應用上，對其控病機理研究卻較少。在此基礎上，針對湖北省辣椒疫病發(fā)生嚴重的狀況，本研究從辣椒根際土壤中分離生防菌株，并對其進行鑒定，初步探討生防菌的抑菌機理，為有效地防治辣椒疫病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotiana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sb. vesinfectum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）均由長江大學生命科學院實驗室保存。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 土樣采集和處理

從武漢、荊州、宜昌和荊門等辣椒種植區(qū)疫病發(fā)生嚴重的田地，利用五點采樣法從生長健康辣椒根際采集土樣。采樣時鏟去表層5 cm土層，取新鮮土樣500 g，用保鮮袋保存。稱取土樣10 g加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中（內裝玻璃珠若干），30 ℃、120 r/min振蕩30 min，靜置后獲得土壤懸液。

1.3 生防細菌的篩選

將土壤懸液稀釋成10-5、10-6、10-7濃度，吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取顏色、形態(tài)等不同的細菌單菌落并純化、保存。采用平板對峙法測定分離到的細菌對辣椒疫霉的抑菌活性。將辣椒疫霉菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑6 mm），接種到PDA平板中央。培養(yǎng)1 d后，在距離辣椒疫霉菌塊2 cm處的4個對接點接種待測細菌，28 ℃培養(yǎng)，5 d后觀察抑菌結果，每個處理設3次重復。

1.4 拮抗菌株的鑒定

將篩選到的抑菌效果較好的菌株進行菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、水解淀粉試驗、甲基紅試驗（M.R）、V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、接觸酶反應試驗、明膠液化試驗、運動性試驗等主要形態(tài)和生理生化指標鑒定[5，6]。參照文獻[7]方法提取疑似枯草芽孢桿菌基因組DNA。根據(jù)已報道的枯草芽孢桿菌16S rDNA的保守區(qū)序列設計引物BsF（5′-TGCACACACCGCCCGT-3′）和BsR（5′-GGGTTGCCCCATTCG-3′），以枯草芽孢桿菌疑似株基因組為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后測序，將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行對比分析，利用MEGA4.1軟件構建進化樹。

1.5 拮抗菌株的抑菌譜試驗

拮抗菌對各試驗病原真菌的拮抗作用均采用平板對峙法，各試驗重復3次。28 ℃下培養(yǎng)5 d后，測量抑菌帶的寬度和菌落半徑，計算拮抗菌對病原真菌生長的抑制率。對病菌生長的抑制率=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%。

1.6 拮抗菌株對辣椒疫病菌菌絲形態(tài)的影響

將辣椒疫病菌在PDA培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)3 d后，用打孔器打取直徑5 mm的菌塊置于盛有20 mL PDA培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)好的辣椒疫病菌菌塊分別用拮抗菌株的無菌培養(yǎng)濾液和菌體懸浮液處理24 h后，以無菌水處理為對照，挑取菌絲在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，每處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選結果

從健康辣椒根際土壤中共分離到185株細菌，從中挑取菌落形態(tài)、顏色與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似的細菌48株。采用平板對峙法測定上述48株細菌的抑菌活性，結果表明有29株能夠抑制辣椒疫霉的生長，但抑菌程度不同。其中抑菌圈直徑為7.0～8.0 mm的有1株，為5.0～7.0 mm的有6株，為3.0～5.0 mm的有22株。編號為Bs04的菌株抑菌效果最強（圖1）。

2.2 拮抗菌株Bs04的鑒定結果

2.2.1 形態(tài)學和生理生化指標 菌株Bs04在NA平板上培養(yǎng)2 d后，菌落圓形或橢圓形，乳白色，中央凹陷，表面干燥，有褶皺，不透明。菌體為桿狀，大小為（0.7～0.8） μm×（2.0～3.0） μm，革蘭氏染色陽性，其他生理生化指標鑒定結果見表1。

2.2.2 16S rDNA序列與同源性分析 以拮抗菌株Bs04的基因組DNA為模板，用BsF和BsR為引物，進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到1條大小約1 500 bp的清晰條帶（圖2），測序結果為1 538 bp。將測序結果在NCBI GenBank上進行序列比對（比對號lcl28017），發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌16S rDNA序列的相似性高達99%，初步確定拮抗菌株Bs04為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將菌株Bs04的16S rDNA序列上傳GenBank，獲得基因序列號KF725636，并利用MEGA4.1軟件進行聚類分析，構建進化樹。由圖3可知，Bacillus subtilis（KF725636）與Bacillus subtilis（KC506778.1）處于一個小分支，同時與另外兩個枯草芽孢桿菌位于一個大分支。由此，進一步表明拮抗菌株Bs04為枯草芽孢桿菌。

2.3 對其他病原真菌的拮抗作用

為了研究拮抗菌株Bs04的生防潛力，采用平板對峙法對其抑菌譜進行了測定。結果表明，拮抗菌株Bs04對供試病原真菌有較高的拮抗活性。由表2可知，拮抗菌株Bs04對辣椒疫霉菌、煙草疫霉菌的抑制率達70%以上，對其他病原真菌的抑制率也在40%以上。表明菌株Bs04的抑菌譜寬，生防潛力較大，具有良好的應用前景。

2.4 對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)的影響

由圖4可知，用去離子水處理的辣椒疫霉菌絲形態(tài)飽滿，細胞壁光滑，菌絲能正常生長并擴展（圖4a）。經(jīng)拮抗菌株Bs04菌體懸浮液和無菌濾液處理后，辣椒疫霉菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，菌絲分支增多，頂端出現(xiàn)畸形，生長緩慢（圖4b與圖4c）；大多數(shù)菌絲還出現(xiàn)了細胞壁加厚，原生質濃縮呈球形或橢圓形的現(xiàn)象，菌絲中間出現(xiàn)許多類似厚壁孢子的細胞（圖4d）。

3 小結與討論

近年來，辣椒疫病發(fā)生日益嚴重，給中國的農業(yè)生產(chǎn)造成了較大的危害。對于辣椒疫病的防治，長期以來使用化學農藥進行防治，導致農藥殘留污染、增強病原菌的抗藥性等不利影響。辣椒疫病作為典型的土傳病害，應用生防菌對其進行防治則顯得至關重要。芽孢桿菌是一類重要的用于土傳性病害的生防細菌。多粘類芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌[8]等能夠抑制多種病原菌的生長，對其引起的病害起到一定的防治作用。

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，具有生長快、營養(yǎng)要求簡單、對人畜無害、能夠抑制多種植物病害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是目前應用廣泛的生防菌[9]?？莶菅挎邨U菌能夠有效抑制玉米串珠鐮孢菌[10]、棉花枯萎病菌[11]、稻瘟病菌[12]等，其抗菌譜較廣。本研究通過平板稀釋法從辣椒根際土壤中分離到了枯草芽孢桿菌Bs04，采用平板對峙法發(fā)現(xiàn)其對辣椒疫霉菌具有較強的拮抗作用，且對其他多種病原真菌具有明顯的抑菌作用，具有較廣的抗菌譜，這與前人的研究結果一致[13-15]。同時，枯草芽孢桿菌Bs04顯著影響辣椒疫霉菌絲形態(tài)，能抑制菌絲的生長和擴展，阻止病原菌的進一步侵染。枯草芽孢桿菌作為目前應用較為廣泛的生防細菌之一，其主要通過根際定殖、分泌抗生素及拮抗蛋白等達到防病目的。本研究中菌株Bs04的防病機理有待進一步研究，而對于其在生產(chǎn)上的應用效果還有待于深入探索。

參考文獻：

[1] 馬曉飛，劉長遠，趙奎華，等.辣椒疫病生防菌株鑒定及控病機理研究[J].中國農學通報，2012，28（10）：136-141.

[2] 梅新蘭，趙青云，譚石勇，等.辣椒疫病拮抗菌株篩選、鑒定及其防效[J].應用生態(tài)學報，2010，21（10）：2652-2658.

[3] LIU H X， LI S M， LUO Y M， et al. Biological control of Ralstonia wilt， Phytophthora blight， Meloidogyne root-knot on bell pepper by the combinationof Bacillus subtilis AR12， Bacillus subtilis SM21 and Chryseobacterium sp. R89[J].European Journal of Plant Pathology， 2014， 139（1）：107-116.

[4] LIM J H， KIM S D. Biocontrol of Phytophthora blight of red pepper caused by Phytophthora capsici using Bacillus subtilis AH18 and B. licheniformis K11 formulations[J]. Journal Korean Soc Appl Biol Chem. 2010，53（6）：766-773.

[5] 趙 斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002.

[6] 東秀株，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[7] KATAOKA M，UEDA K，KUDO T，et al.Application of the variable region in 16S rDNA to create an index for rapid species identification in the genus Streptomyces [J].FEMS Microbiology Letters，1997，151：249-255.

[8] 徐建宏，王建偉，胡曉丹，等.小麥赤霉病菌拮抗菌AF0907的分離鑒定及其拮抗特性[J].江蘇農業(yè)學報，2013，29（3）：517-522.

[9] ASAKA O，SHO DA M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off tomato with Bacillus subtilis RB14[J]. Appl Environ Mircrobiol，1996，62（11）：4081-4085.

[10] BACON C W，YATES I E， HINTON D M， et al. Biological control of Fusarium moniliforme in maize[J]. Environmental Health Perspectives，2001， 109（S2）：325-332.

[11] 曹 君，高智謀，潘月敏，等.枯草芽孢桿菌BS菌株和哈茨木霉TH-1菌株對棉花枯黃萎病的拮抗作用[J].植物病理學報，2005，36（6）：170-172.

[12] 穆長青，劉 雪，陸慶光，等.枯草芽孢桿菌B-332菌株對稻瘟病的防治效果及定殖作用[J].植物保護學報，2007，34（2）：123-128.

[13] WIEHITRA L， PUNPEN H， SAMERCHAI C. Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and theirmetabolites against the green mold pathogen（Penicillium digitatum Sacc） of citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology，2008， 48（1）：113-121.

[14] EEMAN M， PEGADOB L，DUFR NE Y F. Influence of environmental conditions on the inteffacialorgan isation of fengycin， a bioactive lipopeptide produced by Bacillus subtilis[J]. Journal of Colloid and Interface Science，2009，29：253-264.

[15] CHUNG S，KONG H， BUYER J S， et al. Isolation and partial characterization of Bacillus subtilis ME488 for suppression of soilborne pathogens of cucumber and pepper[J]. Appl Microbiol Biotechno，2008，80：115-123.