摘要：選取3種不同濃度的酵母菌制劑（1.67×10-2、5.00×10-2、8.00×10-2 g/mL）分為試驗(yàn)組1、2和3，在4 ℃下保存360 d，每30 d取樣1次，采用稀釋平板法進(jìn)行活酵母菌計(jì)數(shù)，檢測(cè)酵母菌制劑保存的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，試驗(yàn)組1、3的活酵母菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，試驗(yàn)組2的活酵母菌數(shù)呈先下降后升高的趨勢(shì)。在第30、90、180和360 天時(shí)，試驗(yàn)組1酵母菌存活率分別為76.27%、28.64%、20.85%和11.10%，試驗(yàn)組2酵母菌存活率分別為106.25%、13.63%、121.25%和101.88%，試驗(yàn)組3酵母菌存活率分別為126.37%、90.11%、69.78%和56.04%。可見(jiàn)，酵母菌制劑試驗(yàn)組3保存的穩(wěn)定性良好，4 ℃條件下保存期可達(dá)到180 d以上。

關(guān)鍵詞：酵母菌；制劑；保存；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S859.1；Q93-336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1661-03

在抗生素限制使用的時(shí)代，微生態(tài)制劑作為較理想的替代品被廣泛應(yīng)用。微生態(tài)制劑又稱為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，是指可以提高人類、畜禽宿主或植物寄主等健康水平和促進(jìn)生長(zhǎng)的菌群及其代謝產(chǎn)物的制品[1]，具有無(wú)毒副作用、無(wú)殘留和無(wú)耐藥性等特性。目前，用于微生態(tài)制劑的微生物主要有芽孢桿菌屬、乳桿菌屬和酵母菌屬等[2]。其中，酵母菌屬于兼性厭氧型真菌，可以耐受一定劑量的抗生素，而大多微生態(tài)制劑是細(xì)菌制劑，對(duì)抗生素敏感，所以酵母菌能在含有抗生素的機(jī)體或環(huán)境中應(yīng)用，并逐漸取代抗生素。此外，酵母菌菌體含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等成分，還可以分泌酶類、糖類、脂類和生長(zhǎng)因子等[3]。酵母菌是繼動(dòng)物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì)之后的一種重要蛋白質(zhì)來(lái)源，又有“菌體蛋白質(zhì)”之稱[4]。研究表明，每100 kg干酵母所含的蛋白質(zhì)，相當(dāng)于500 kg大米、217 kg大豆或250 kg豬肉所含蛋白質(zhì)的含量[5]。

酵母菌有著悠久的應(yīng)用史，尤其在面包制作和釀酒行業(yè)。近幾年，酵母菌以微生態(tài)制劑的形式廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品、飼料等行業(yè)。酵母菌制劑主要作為多功能食品、保健品、添加劑和醫(yī)藥品，甚至用作含重金屬?gòu)U水的凈化劑等[6，7]。微生態(tài)制劑中起重要作用的是活性微生物，保證制劑中活性微生物的含量對(duì)其發(fā)揮益生作用至關(guān)重要。

酵母菌制劑保存的穩(wěn)定性是指該制劑從制備到使用期間活酵母菌數(shù)的變化速度和程度，是評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。穩(wěn)定性研究是制劑質(zhì)量控制研究的主要內(nèi)容之一，與制劑質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立緊密相關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)酵母菌制劑在一定條件下活菌數(shù)隨時(shí)間變化規(guī)律進(jìn)行研究，掌握制劑保存的穩(wěn)定性變化，為制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 酵母菌液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 瓊脂粉購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；麥芽汁購(gòu)自蘭州啤酒廠；固體麥芽汁：瓊脂粉+麥芽汁。

1.1.3 儀器 電子天平（武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司），PHSJ-4F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），LDZX-30KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），BS-2F型數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（金壇市華城開(kāi)元實(shí)驗(yàn)儀器廠），恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.2 方法

取1 mL濃度為1.0×107 CFU/mL的酵母菌液加入99 mL麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后4 ℃保存，作為供試菌液。將供試菌液從4 ℃取出后室溫放置1 h，置于搖床1 h（速度110 r/min），以使菌液均勻。取100 μL菌液加入到9 900 μL無(wú)菌生理鹽水中，菌液濃度稀釋10-1，振蕩1 min，依次稀釋10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，選取3種不同濃度供試菌液（1.67×10-2、5.00×10-2、8.00×10-2 g/mL）作為試驗(yàn)處理，分別為試驗(yàn)組1、2和3，涂布于固體麥芽汁培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)48～72 h（做3次平行，取其平均值）。試驗(yàn)組1、2和3添加某種物質(zhì)，對(duì)照組不添加該種物質(zhì)。將3種不同濃度酵母菌制劑及其同期對(duì)照組于冰箱4 ℃保存，試驗(yàn)期為360 d，每30 d取樣1次，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活酵母菌計(jì)數(shù)，以平均活酵母菌數(shù)表示制劑保存的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

對(duì)不同濃度酵母菌制劑及其同期對(duì)照組進(jìn)行0～360 d保存穩(wěn)定性的檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組1、3的活酵母菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，試驗(yàn)組2的活酵母菌數(shù)呈先下降后升高的趨勢(shì)；在相同時(shí)間內(nèi)，除試驗(yàn)組2保存90 d外，所有試驗(yàn)組的酵母菌存活率均高于對(duì)照組；與保存90～360 d相比，在0～90 d內(nèi)試驗(yàn)組1、3和對(duì)照組的活酵母菌數(shù)存活率均偏高。在第30、90、180和360天時(shí)，試驗(yàn)組1酵母菌存活率分別為76.27%、28.64%、20.85%和11.10%，試驗(yàn)組2酵母菌存活率分別為106.25%、13.63%、121.25%和101.88%，試驗(yàn)組3酵母菌存活率分別為126.37%、90.11%、69.78%和56.04%。試驗(yàn)組1酵母菌存活率均低于試驗(yàn)組2和3；試驗(yàn)組2酵母菌存活率大部分測(cè)定時(shí)間高于100%。說(shuō)明酵母菌制劑試驗(yàn)組3保存的穩(wěn)定性良好。

3 小結(jié)與討論

目前，微生態(tài)制劑保存的穩(wěn)定性是確保制劑使用效果的基礎(chǔ)。張世風(fēng)等[8]報(bào)道溫度對(duì)菌種保存期存活率影響最大，微生物添加劑保存溫度一般為2～8 ℃。鐘青萍等[9]報(bào)道納豆菌微生態(tài)制劑在4 ℃冷藏保存，有較好的穩(wěn)定性。因此，本試驗(yàn)選取4 ℃冷藏保存酵母菌制劑。

近年來(lái)，大多微生態(tài)制劑通過(guò)膠囊化、添加保護(hù)劑和凍干等形式，提高制劑保存穩(wěn)定性。宋文龍等[10]采用乳化和擠壓法包埋枯草芽孢桿菌活菌制劑；徐暉等[11]研究微膠囊化枯草芽孢桿菌制劑，均在4 ℃冷藏下保存，提高了制劑保存的穩(wěn)定性。彭虹旎等[12]報(bào)道添加保護(hù)劑的屎腸球菌凍干樣品，在4 ℃存放4周后，存活率高于97.90%。蔡凱凱[13]將納豆芽孢桿菌制劑制成凍干產(chǎn)品4 ℃存放1個(gè)月，菌制存活率為91.4%；固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品4 ℃存放1個(gè)月，菌制存活率為49.1%。本試驗(yàn)制備不同濃度酵母菌制劑，于4 ℃冷藏保存，測(cè)定酵母菌制劑的保存穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明濃度不同，酵母菌制劑的酵母菌存活率不同。在不同時(shí)期，試驗(yàn)組1酵母菌存活率均低于試驗(yàn)組2和3；試驗(yàn)組2酵母菌存活率大部分時(shí)間高于100%；試驗(yàn)組3酵母菌存活率逐漸下降，但180 d時(shí)酵母菌存活率為69.78%，360 d時(shí)還高于50%。相關(guān)研究表明，在低于0 ℃或高于47 ℃時(shí)，酵母菌一般不會(huì)增殖。試驗(yàn)組2酵母菌存活率大部分時(shí)間高于100%，可能是酵母菌在4 ℃保存時(shí)增殖引起的，有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)各試驗(yàn)組酵母菌存活率的結(jié)果與沈麗琳等[14]報(bào)道基本一致，并且優(yōu)于史懷平[15]的報(bào)道結(jié)果。此外，在不同時(shí)期，除試驗(yàn)組2保存90 d外，本試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組的酵母菌存活率均高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母菌制劑試驗(yàn)組3保存的穩(wěn)定性良好，4 ℃條件下保存期為180 d時(shí)，酵母菌存活率較高。選擇適宜的濃度可以提高酵母菌制劑保存的穩(wěn)定性，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 康 白.微生態(tài)學(xué)原理[M].遼寧大連：大連出版社，1996.2.

[2] SEKHON B S，JAIRATH S. Prebiotics， probiotics and synbiotics： An overview[J]. Journal Pharmaceutical Education Research，2010，1（2）：13-36.

[3] PANDEY A. Concise Encyclopedia of Bioresource Technology[M].New York：Food Products Press，2004.

[4] 王 卓，顧正彪，洪 雁.馬鈴薯渣的開(kāi)發(fā)與利用[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22（2）：133-136.

[5] 孫萬(wàn)儒.酵母菌[J].生物學(xué)通報(bào)，2007，42（11）：5-10.

[6] BEKATOROU A， PSARIANOS C， KOUTINAS A A. Production of food grade yeasts[J]. Food Technology and Biotechnology， 2006， 44（3）： 407-415.

[7] FERREIRA I， PINHO O，VIEIRA E， et al. Brewer's Saccharomyces yeast biomass：Characteristics and potential applications[J]. Trends in Food Science Technology， 2010， 21（2）：77-84.

[8] 張世風(fēng)，翟建新.影響飼用微生物添加劑作用效果的原因淺析[J].河南畜牧獸醫(yī)，1999，20（3）：22-23.

[9] 鐘青萍，王發(fā)祥，鐘士清，等.納豆菌微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué)，2006，27（3）：133-136.

[10] 宋文龍，叢麗娜，王紅英.枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化及微生態(tài)制劑的研制[J].食品工業(yè)科技，2013，34（17）：206-209.

[11] 徐 暉，魏培蓮.枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研制[J].氨基酸和生物資源，2008，30（2）：56-58.

[12] 彭虹旎，梁 莉，陳西廣.屎腸球菌冷凍干燥保護(hù)劑篩選及穩(wěn)定性比較研究[J].食品科學(xué)，2013，34（3）：239-242.

[13] 蔡凱凱.以米糠為基質(zhì)納豆芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研究[D]. 南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[14] 沈麗琳，夏啟明，胡俊敏，等.乳酸桿菌栓劑的研制及其質(zhì)量控制[J].天津藥學(xué)，2004，16（2）：35-36.

[15] 史懷平.朱鸚消化道正常菌群的分離鑒定及微生態(tài)制劑的研究 [D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.