摘要：以體視鏡拍攝的水稻（Oryza sativa）中旱5號(hào)（ZH5）和珍汕97（ZS97）的主根照片為研究對(duì)象，利用圖像分析軟件Image J建立了一種全新的水稻根毛長(zhǎng)度測(cè)量方法。在不同的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下，分別對(duì)位于水稻主根不同部位根毛的長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到一組最優(yōu)的水稻根毛的測(cè)量方法和測(cè)量條件。用所建立的水稻根毛長(zhǎng)度測(cè)量體系，對(duì)兩組肉眼觀察根毛長(zhǎng)度無(wú)明顯差異的水稻品種進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果表明，此種方法可以檢測(cè)出兩個(gè)水稻品種間根毛長(zhǎng)度的差異。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa）；根毛；長(zhǎng)度測(cè)量；Image J軟件

中圖分類號(hào)：S511；TP391 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1722-04

水稻是單子葉植物的模式植物，也是重要的糧食作物。目前對(duì)于水稻地下部分的研究相對(duì)薄弱。根系是植物吸收外界水分、養(yǎng)分的主要器官，環(huán)境條件和栽培措施大多是首先通過(guò)影響根系的發(fā)育，進(jìn)而影響到植株地上部分的生長(zhǎng)。根毛是根的成熟區(qū)表皮細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)突起。大部分被子植物的表皮細(xì)胞分為生毛細(xì)胞（H細(xì)胞）和非生毛細(xì)胞（N細(xì)胞）。以前一直認(rèn)為水稻根毛是由表皮細(xì)胞不對(duì)稱分裂后形成小的子細(xì)胞分化產(chǎn)生的，但近期的研究表明水稻根的表皮細(xì)胞是對(duì)稱分裂的，根毛發(fā)達(dá)后生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞的擴(kuò)增速率快，導(dǎo)致根毛成熟時(shí)生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞要小。生毛細(xì)胞比非生毛細(xì)胞的擴(kuò)增速率快可能與生毛細(xì)胞是重要的吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的器官有關(guān)[1]。

Image J是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health）開發(fā)的一個(gè)基于JAVA的圖像處理軟件，可以顯示、編輯、分析、處理多種圖片格式，由于其操作簡(jiǎn)單有效已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[2-4]。本研究利用Image J軟件首次建立了水稻根毛長(zhǎng)度的測(cè)量方法，使準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地量化水稻根毛的長(zhǎng)度成為可能；利用所建立的根毛測(cè)量方法對(duì)兩組肉眼所見根毛長(zhǎng)度無(wú)明顯差異的水稻品種進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)此種方法可以揭示出不同水稻品種間根毛長(zhǎng)度的差異，從而證明了該測(cè)量體系的可行性和有效性，為進(jìn)一步研究水稻根毛發(fā)育及其影響因素打下了量化分析基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻：中旱5號(hào)（ZH5）、珍汕97（ZS97），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1）1/2 MS培養(yǎng)基配制。培養(yǎng)基配方為：2.2 g MS粉末、10 g蔗糖、0.5 g MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）、10 g瓊脂，去離子水定容至1 L。調(diào)節(jié)pH至5.8，高溫高壓滅菌15 min后倒入 13 cm×13 cm透明的塑料方形培養(yǎng)皿中，凝固后備用。

2）種子滅菌及幼苗生長(zhǎng)。將去掉穎殼的水稻種子分裝在錐形瓶中，加入適量75%（V/V）的乙醇搖晃1 min，棄去乙醇，加入0.15%（m∶V）升汞搖晃15 min，棄去升汞，最后用滅菌水清洗3～5次。將滅過(guò)菌的水稻種子橫向（胚背向培養(yǎng)基一側(cè)）擺放在1/2 MS培養(yǎng)基上，每皿10粒。將培養(yǎng)皿封口后豎直向后傾斜15°～20°放置，使根能貼在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)。28 ℃光/暗（16 h/8 h）培養(yǎng)或 28 ℃暗培養(yǎng)2 d或3 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根毛的圖像采集

去掉水稻幼苗培養(yǎng)皿封口膜后背面朝上，用體視顯微鏡（Leica S8 APO；CCD：DFC290）拍照，參數(shù)設(shè)置為：1×、曝光440.3、飽和度0.85、伽瑪1.84、增益1.84×。

2.2 水稻根毛的測(cè)量

啟動(dòng)Image J軟件，選擇File→Open（圖1A）打開所拍攝的水稻主根的體視鏡圖片；Analyze→Set Measurements（圖1E）確定標(biāo)尺；選擇Rectangular Selection工具（圖1B），默認(rèn)設(shè)置，將所需測(cè)量的部位選定，按鍵盤上的“Ctrl+C”鍵，將所選區(qū)域復(fù)制，F(xiàn)ile→New→Internal Clipboard，所復(fù)制的區(qū)域會(huì)作為一個(gè)獨(dú)立的窗口出現(xiàn)；用Freehand工具，默認(rèn)設(shè)置，將主根選中（圖1C），選擇Analyze→Measure（圖1D）得到主根的面積；選擇Image→Type→8-bit（圖1F）將圖像調(diào)整為灰度模式；選擇Image→Adjust→Threshold（圖1G）通過(guò)拖動(dòng)標(biāo)桿（圖1H）將根毛和主根選中，然后選擇Apply，選擇Analyze→Analyze Particles（圖1I）會(huì)彈出一個(gè)設(shè)置框，調(diào)整Size（pixel〈2）→1，Show→Outlines→OK，這時(shí)會(huì)輸出根毛和主根的面積和（圖1J）。根據(jù)公式：根毛的平均長(zhǎng)度=（根毛和主根的面積和-主根的面積）/（2×所選區(qū)域的長(zhǎng)度），得到根毛的平均長(zhǎng)度。

2.3 水稻根毛測(cè)量方法的優(yōu)化

以ZH5和ZS97為材料，選取尖端（從距根毛起始處1 mm開始向上4 mm的區(qū)域，圖2A白色箭頭區(qū)域）、基部（從種子端開始向下4 mm的區(qū)域，圖2B）和整體（基部和尖端根毛的平均值）的根毛長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。培養(yǎng)條件和時(shí)間也做了相應(yīng)的改變，28 ℃光/暗（16 h/8 h）培養(yǎng)或 28 ℃暗培養(yǎng)2d 或3 d。

2.3.1 培養(yǎng)條件的確定 在光、暗條件下培養(yǎng)2 d，分別對(duì)根的尖端、基部和整體的根毛長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明，在光、暗條件下ZH5和ZS97兩個(gè)品種間各個(gè)部位的根毛長(zhǎng)度差異都極顯著，但在光培養(yǎng)條件下兩個(gè)品種間尖端、基部、整體的P值（分別為4.00E-11、4.06E-08、3.13E-12）遠(yuǎn)小于暗培養(yǎng)下兩個(gè)品種間的P值（分別為5.3E-04、2.25E-03、9.2E-04），所以選定光培養(yǎng)為進(jìn)行根毛長(zhǎng)度測(cè)量的理想條件。

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間的確定 分別光培養(yǎng)2 d和3 d，對(duì)根的尖端、基部和整體的根毛長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明，光下培養(yǎng)2 d和3 d時(shí)，ZH5和ZS97兩個(gè)品種間各個(gè)測(cè)量部位的根毛長(zhǎng)度差異都極顯著；但在光培養(yǎng)2 d時(shí)ZH5種內(nèi)也有顯著性差異（基部的根毛長(zhǎng)度和整體的根毛長(zhǎng)度相比其P值為0.039），表明光培養(yǎng)2 d時(shí)根毛的長(zhǎng)度尚未穩(wěn)定，所以選定3 d為測(cè)量根毛長(zhǎng)度所需的培養(yǎng)時(shí)間。

2.3.3 測(cè)量部位的確定 光培養(yǎng)3 d，ZH5和ZS97種間根毛長(zhǎng)度相比，各部位相比差異都極顯著，尖端（P值為1.194 E-12）的差異比整體（P值為6.783E-09）和基部（P值為3.126E-05）的要更為顯著（圖3，表1）；ZH5和ZS97種內(nèi)根毛長(zhǎng)度相比，尖端和基部的根毛長(zhǎng)度與整體相比差異都不顯著（表1），所以可以用尖端的根毛長(zhǎng)度來(lái)衡量水稻根毛的長(zhǎng)度。

由上述結(jié)果可以得出，水稻根毛長(zhǎng)度測(cè)量體系的條件為：水稻光培養(yǎng)3 d，以尖端根毛的長(zhǎng)度來(lái)衡量整體根的根毛長(zhǎng)度。

2.4 水稻根毛測(cè)量方法的應(yīng)用

為了驗(yàn)證上述所建立的根毛測(cè)量體系是否切實(shí)可行，對(duì)圖4中肉眼所見根毛長(zhǎng)度無(wú)明顯差異的兩個(gè)水稻品種根毛長(zhǎng)度進(jìn)行了測(cè)量，其中A、B、C為同一品種，D、E、F為另一品種。結(jié)果顯示，圖4A～F的水稻根毛長(zhǎng)度分別為144.595、172.804、197.843、297.648、351.781、405.156 μm。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，A、B間P值為2.418E-03，B、C間P 值為 2.74E-02，A、C間P值為1.14E-06，D、E間P值為1.25E-02，E、F間P值為4.06E-02，D、F間P值為2.74E-05，這兩組內(nèi)3個(gè)樣本間根毛長(zhǎng)度的差異都是顯著的，從而證明了所建立的根毛長(zhǎng)度測(cè)量體系可以用于根毛長(zhǎng)度的量化分析，能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出各水稻品種間根毛長(zhǎng)度的差異。

3 小結(jié)與討論

根毛的長(zhǎng)度決定了根和根際接觸的面積大小，進(jìn)而對(duì)根吸收水分和營(yíng)養(yǎng)有重大的影響。關(guān)于根毛初始和伸長(zhǎng)的基因已經(jīng)有相關(guān)的報(bào)道，在水稻中OsCSLD1、OsAPY、RHL1參與根毛的伸長(zhǎng)。根毛的初始和伸長(zhǎng)都需要細(xì)胞壁松弛蛋白EXPs。EXP有兩個(gè)亞家族EXPA和EXPB，有很多EXPA和EXPB成員已經(jīng)證實(shí)在細(xì)胞壁松弛和快速擴(kuò)張中起重要的作用[5-10]。隨著相關(guān)基因的分離，為進(jìn)一步研究水稻根毛發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

由于根毛是根成熟區(qū)表皮細(xì)胞的細(xì)長(zhǎng)突起，很容易受到損壞。水稻植株較大，根毛密集，所以對(duì)水稻根毛長(zhǎng)度的測(cè)量有一定的難度。試驗(yàn)采用在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的水稻幼苗作為根毛測(cè)量的對(duì)象，不僅容易控制而且結(jié)果穩(wěn)定可靠。雖然以前也有研究測(cè)量過(guò)根毛的長(zhǎng)度，但都是取根的特定部分的若干根毛，測(cè)量其長(zhǎng)度作為根毛的長(zhǎng)度[10]，其測(cè)量的長(zhǎng)度有時(shí)不能代表整個(gè)根的根毛長(zhǎng)度。而該研究采用軟件統(tǒng)計(jì)的方法建立了一個(gè)新的水稻根毛長(zhǎng)度的測(cè)量方法，用所選區(qū)域根毛長(zhǎng)度的平均值來(lái)衡量整體根毛的長(zhǎng)度，使得到的數(shù)據(jù)更有說(shuō)服力。創(chuàng)建的基于Image J軟件的水稻根毛長(zhǎng)度測(cè)量方法，使對(duì)水稻根毛長(zhǎng)度的精確量化分析成為可能，將有助于水稻根毛發(fā)育相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及其功能研究，進(jìn)一步推動(dòng)水稻水分、養(yǎng)分吸收研究的發(fā)展。

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