【摘 要】頭孢曲松鈉屬第三代頭孢菌素，具廣譜抗菌作用.本實驗對注射用頭孢曲松鈉無菌檢查方法進行驗證驗證。方法：采用薄膜過濾法以500ml/筒緩沖液沖洗量檢查，結(jié)果：頭孢曲松鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。

【關(guān)鍵詞】注射用頭孢曲松鈉；無菌檢查；驗證

頭孢曲松鈉屬第三代頭孢菌素，具廣譜抗菌作用，對流感嗜血桿菌、腸桿菌科細菌、淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌有較強抗菌作用，對陰溝腸桿菌、不動桿菌屬和銅綠假單胞菌作用較差[1-5]。頭孢曲松鈉化學(xué)名為[6R-[6a，7b（Z）]]-7[[2，3-二氫-2-亞氨基-4-噻唑基）（甲氧亞氨基）乙?；鵠氨基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜二環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸鈉鹽[6-8]。頭孢曲松鈉常用于肺炎、燒傷感染、腹膜炎、支氣管炎、尿道感染、敗血癥、腦膜炎、皮膚及傷口的感染、胃腸道感染、肺化膿癥、腎臟感染、生殖器感染等[9-10]。無菌檢查采用薄膜過濾法是取樣量較大的集菌方法，具有代表性，不易漏檢等特點[11-13]。本實驗對注射用頭孢曲松鈉無菌檢查方法進行驗證驗證。

1.試驗環(huán)境與材料

1.1試驗環(huán)境

在環(huán)境潔凈度為B+A的無菌室中進行。

1.2儀器

NKF330一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）、HTY-601智能集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）、HY-2（A）調(diào)速多用振蕩器（常州華冠儀器制造有限公司）、SPX-250智能生化培養(yǎng)箱（常州華冠儀器制造有限公司）、MJX-150B智能霉菌培養(yǎng)箱（常州華冠儀器制造有限公司）、YXQ-LS-30SII高壓滅菌鍋（西安常儀儀器設(shè)備有限公司）、FB224電子分析天平（江蘇淮安翔宇電子衡器公司）。

1.3試驗用菌株

生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]（第4代）、大腸埃希菌ECMCC（B）44lO23（第3代）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）。

1.4培養(yǎng)基、稀釋液及緩沖液

1.4.1干粉培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（湖北鑫潤德化工有限公司）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（威海新月化玻儀器有限公司）、改良馬丁培養(yǎng)基（上海研域生物科技有限公司）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（上海研域生物科技有限公司）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（威海新月化玻儀器有限公司）。

1.4.2細菌稀釋液

氯化鈉溶液（廣州百特醫(yī)療用品有限公司）。

1.4.3沖洗用緩沖液

pH 7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液（上海研域生物科技有限公司）。

2.方法與結(jié)果

2.1菌液制備

（1）取經(jīng)30℃～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的肉湯培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-7，備用。

（2）取經(jīng)30℃～35℃培養(yǎng)18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-7備用。

（3）取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-6，備用。

（4）取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)5～7天的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，取1ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，備用。

2.2菌液計數(shù)

每種菌液接種2個平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入約15毫升、45攝氏度改良馬丁瓊脂平皿，經(jīng)26攝氏度生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時，金黃色葡萄球菌液、枯草芽孢桿菌液、生孢梭菌液、大腸埃希菌液各1ml，注入約15 毫升、45攝氏度營養(yǎng)瓊脂平皿，經(jīng)36攝氏度生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，活菌計數(shù)。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落數(shù)78cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落數(shù)65cfu/ml，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落數(shù)75cfu/ml，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落數(shù)，69cfu/ml，大腸埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落數(shù)82cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落數(shù)62cfu/ml。

2.3方法的驗證采用薄膜過濾法

2.3.1供試液制備

取供試品15支溶于500ml0.9%的無菌氯化鈉溶液中，分別置于七個濾筒中過濾，沖洗液用量為每筒500ml，每次50ml，在最后一次沖洗中分別加入1ml已制備好的上述7株菌液（約為10～100個/筒），依照2010年版《中國藥典》二部附錄無菌檢查法，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)14天。逐日觀察。

2.3.2對照組

另取7個濾筒，分別加入1ml相應(yīng)的試驗菌，再加入相應(yīng)等量培養(yǎng)基，作為對照，按規(guī)定條件培養(yǎng)14天，逐日觀察。

2.3.3供試品對照組

取供試品15支，溶于500ml0.9%的無菌氯化鈉溶液中，分別置于2個濾筒中過濾，沖洗濾膜數(shù)次，每次50ml，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，依照2010年版《中國藥典》二部無菌檢查法，按規(guī)定條件培養(yǎng)14天，逐日觀察。

2.3.4空白對照組

取試驗用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)14天，逐日觀察。

2.3.5陰性對照組

取沖洗用0.1%蛋白胨緩沖液及0.9%的無菌氯化鈉溶液適量，分置于兩個濾筒中過濾，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)14天，逐日觀察。

2.3.6培養(yǎng)

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基桶30～35℃培養(yǎng)；真菌培養(yǎng)基桶23～28℃培養(yǎng)，培養(yǎng) 14d。每天觀察并記錄。

結(jié)果表明，頭孢曲松鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。注射用頭孢曲松鈉采用薄膜過濾法進行無菌檢查時，緩沖液沖洗量以500ml/筒為宜，可以選擇大腸埃希菌或金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。

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