摘 要：血凝抑制試驗具有所需器材簡單、操作方便、試驗結(jié)果判定快速等優(yōu)點，但該試驗影響因素很多，常造成檢測結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。本文從試驗器材、試劑、待檢血清、緩沖液、紅細(xì)胞、微量血凝板、環(huán)境溫度及其他影響因素進(jìn)行綜合分析，旨在避免或減少不利因素的影響，提高試驗的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：禽流感；新城疫；產(chǎn)蛋下降綜合征；血凝抑制試驗；影響因素

中圖分類號：S852.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）10-0059-03

血凝抑制試驗（HI）由于所需器材簡單、操作方便、試驗時間短等優(yōu)點，是一種在基層臨床實踐中極易推廣的檢測手段與診斷方法。然而，在血凝抑制試驗方面，由于受個人技術(shù)、試驗條件、環(huán)境等諸多因素的限制與影響，影響了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確甚至錯誤?，F(xiàn)分析如下。

1 器材的選擇和使用

為獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，嚴(yán)格按相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序使用單道、多道移液器，使其始終保持最佳工作狀態(tài)。新購移液器在使用前、舊移液器在使用一段時間后均應(yīng)進(jìn)行校正或鑒定。選購正規(guī)廠家生產(chǎn)、質(zhì)量較好的微量反應(yīng)板、吸頭等一次性耗材。

1.1 單道、多道移液器使用注意事項

（1） 吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，不允許突然松開，以免因吸液過快，液體沖入加樣器內(nèi)，使柱塞腐蝕而造成漏氣；

（2） 為獲得較高的精確度，在正式加樣前，按緊吸頭后先吸取溶液一次，濕潤吸頭，直接吸取因吸頭內(nèi)壁應(yīng)殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差；

1.2 96孔V型微量反應(yīng)板

（1） 建議采用96孔110°V型有機反應(yīng)板進(jìn)行血凝試驗（HA），但注意不要使用底部磨損嚴(yán)重和底部不干凈的反應(yīng)板。采用一次性優(yōu)質(zhì)塑料反應(yīng)板（90°或110°均可）進(jìn)行HI。

（2） 使用有機反應(yīng)板進(jìn)行HI時，建議按如下程序清洗：試驗結(jié)束后，立即用帶有壓力的自來水反復(fù)沖洗（以看不到孔底有紅血球為準(zhǔn)），用力甩干孔內(nèi)剩余的水滴，需要時反扣在吸水紙上排干。置2 %～3 %濃度的鹽酸浸泡過夜（12 h以上）后，撈出反應(yīng)板并小心將孔內(nèi)殘留鹽酸甩到鹽酸缸內(nèi)，用自來水沖洗后，用蒸餾水沖洗2～3次，甩干水分置溫箱中烘干備用。及時淘汰損壞和底部洗不干凈的反應(yīng)板。

（3） 不建議使用鑷子夾棉花或使用試管刷涮洗有機反應(yīng)板凹孔，以免對反應(yīng)板板面和孔內(nèi)造成損傷。

（4） 建議購買材質(zhì)較好的有機反應(yīng)板，試驗前應(yīng)盡可能挑選干凈、內(nèi)孔壁平滑工整的反應(yīng)板，避免因板子質(zhì)量問題造成試驗結(jié)果的偏離。有機反應(yīng)板材質(zhì)有好有壞，價格便宜的反應(yīng)板質(zhì)量差、多內(nèi)孔粗糙、V型底部不工整。因此在采購時，需要進(jìn)行挑選。以減少因反應(yīng)板對血球凝集和結(jié)果的判定產(chǎn)生影響。

2 選擇相應(yīng)的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

HA與HI試驗，雖然原理相同、方法相似，但禽流感、新城疫和產(chǎn)蛋下降綜合征等病各自執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)卻不盡相同，特別是有些關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在較大差異?！陡咧虏⌒郧萘鞲性\斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003）、《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550-2008）和《產(chǎn)蛋下降綜合征診斷技術(shù)》（NY/T 551-2002）三個標(biāo)準(zhǔn)對HA與HI試驗中紅血球的離心速度要求存在明顯差異。NY/T 551-2002中抗原對照設(shè)置也不同于前兩個標(biāo)準(zhǔn)，所用稀釋液也非PBS，而是生理鹽水。并且前兩個標(biāo)準(zhǔn)與《SPF雞紅細(xì)胞凝集抑制試驗》（GB/T 17999.2-2008）中的要求也不相同。因此，不同的檢測項目應(yīng)選用相應(yīng)的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來開展檢測，確保試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性和規(guī)范化，是保證試驗結(jié)果準(zhǔn)確性和一致性的重要前提。

3 配液用量具

配液時選擇精準(zhǔn)度高的容量瓶、玻璃吸管和移液器。建議不要使用精準(zhǔn)度低的量筒（特別是大量程量筒和圓錐形量筒誤差更大）和注射器，量筒一般用于精確度要求不是太高的液體配制（如洗液、消毒液等），普通注射器的準(zhǔn)確性也不高。

4 試劑

4.1 稀釋液

4.1.1 磷酸鹽試劑

不同的檢測項目，要求使用的稀釋液（磷酸鹽緩沖液PBS）不同。特別是高致病性禽流感和新城疫檢測所用稀釋液采用的化學(xué)試劑有差異。磷酸鹽必須選用分析純的試劑，稱量前應(yīng)注意選用相應(yīng)要求的試劑，結(jié)晶水分子數(shù)不一樣或進(jìn)行結(jié)晶水分子換算。

4.1.2 滅菌和pH值調(diào)整

配好的PBS須及時進(jìn)行高壓滅菌或過濾。而且在高壓滅菌后，需要對稀釋液的pH值進(jìn)行再次調(diào)整。PBS pH值必須滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

4.1.3 稀釋液

禽流感和新城疫試驗使用的稀釋液必須為0.01 mol/L pH值7.0～7.2的PBS，最好不要用生理鹽水，因為PBS對其他酸堿物質(zhì)具有一定的緩沖能力，能維持反應(yīng)體系的pH值，而生理鹽水不具備緩沖功能。試驗中使用的PBS在pH值在5.18以下，易造成紅細(xì)胞自凝，pH值在7.3以上時凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，而pH值為7.0～7.2時紅細(xì)胞沉淀最充分，觀察效果最理想。

4.1.4 抗凝劑

選用分析純檸檬酸三鈉配制，濃度為3.8 %，配好后進(jìn)行高壓滅菌。

4.2 1 %紅細(xì)胞制備

（1） 為防止血球發(fā)生自凝，采血時應(yīng)用預(yù)先吸有3.8 %檸檬酸鈉采集至少3只SPF公雞無禽流感與新城疫等抗體的健康公雞血液，所采血液與抗凝劑按4∶1～5∶1的比例混合，采完后應(yīng)及時把針管小心顛倒幾次，避免出現(xiàn)凝血塊或溶血。

（2） 離心洗滌紅細(xì)胞時，選擇10 mL左右的“V”型玻璃離心管進(jìn)行紅細(xì)胞洗滌，建議不要使用5 mL或10 mL等大小的“U”型塑料離心管洗滌紅細(xì)胞，因“U”型離心管離心時紅細(xì)胞沉淀不徹底，進(jìn)而影響洗滌效果，最終影響紅細(xì)胞質(zhì)量。

（3） 按相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇不同的離心速度進(jìn)行離心。禽流感抗體檢測1 000 rpm離心10 min，新城疫抗體檢測2 000 rpm離心5 min～10 min，產(chǎn)蛋下降綜合征抗體檢測2 000 rpm離心5 min 2次，第3次離心10 min。

4.3 抗原和陽性血清

（1） 新的未開封凍干抗原和陽性血清，按抗原瓶身說明要求用1 mL移液器取相應(yīng)要求量的PBS（產(chǎn)蛋下降綜合征用生理鹽水）進(jìn)行稀釋；

（2） 已稀釋配制好但暫時不使用的濃縮抗原、陽性血清和均應(yīng)在冰箱4 ℃保存，有條件的實驗室4HAU抗原可放置在實驗臺面上的冰盒內(nèi)。

（3） 4HAU抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。為驗證測出的濃縮抗原血凝價和4HAU抗原配制是否準(zhǔn)確，須做4HAU抗原回歸試驗：取0.025 mL的PBS加入反應(yīng)板的第2～6孔；將配制好的4HAU抗原 0.025 mL分別加入第1和2孔，然后從第 2孔依次倍比稀釋至第6孔，最后棄去0.025 mL；各孔再加PBS 0.025 mL，最后加1 %紅細(xì)胞懸液0.025 mL混勻，室溫靜置30 min觀察結(jié)果。若4HAU、2HAU和1HAU能使1 %紅細(xì)胞完全凝集，而1/2HAU、1/4HAU和1/8HAU不能完全抑制，說明4 HAU配制準(zhǔn)確，否則需要重新測定濃縮抗原的HAU或?qū)? HAU濃度進(jìn)行微調(diào)，直至抗原回歸試驗成立。

5 操作

（1） 使用微量移液器移液時慢吸慢放，以保證加樣的準(zhǔn)確性和避免樣品和試劑加在孔壁上或濺出板孔產(chǎn)生氣溶膠。加樣時移液器吸頭應(yīng)垂直加入液體，禁止與孔內(nèi)液體接觸。不允許移液器吸頭插入反應(yīng)板孔內(nèi)液面下加液體，防止發(fā)生交叉污染；首次加液時盡量將所加液體加在V型板的底部，避免加在孔壁上部；

（2） 加樣的順序應(yīng)該是由低濃度到高濃度，即先加低濃度孔（第12孔），后加高濃度孔（第1孔），以減少樣品加入時造成交叉污染；

（3） 倍比稀釋時不能速度太快、用力過猛，避免產(chǎn)生過多氣泡，使吸頭內(nèi)有大量氣泡，造成移液量誤差，影響反應(yīng)過程，造成檢測結(jié)果的偏離；

（4） 1 %紅細(xì)胞懸液在試驗過程中須隨時用隨時搖勻，使之呈均質(zhì)狀態(tài)。

（5） 每個反應(yīng)板盡量都要設(shè)置陰陽性對照，以驗證試驗是否成立。

6 孵育溫度與時間

孵育溫度對試驗的影響較大，溫度既影響HA與HI的滴度，也會影響反應(yīng)的速度。從4 ℃～37 ℃，隨著溫度的上升，HA與HI的滴度隨之升高。溫度過低反應(yīng)速度減慢，溫度過高會使反應(yīng)結(jié)果洗脫加快，所以孵育溫度?？刂圃谑覝兀?0 ℃～25 ℃）。此外，孵育時間須嚴(yán)格控制在20 min～40 min之間。HI試驗的反應(yīng)時間與試驗環(huán)境溫度成反比，即環(huán)境溫度越高所需反應(yīng)時間相對較短；環(huán)境溫度低于4 ℃時紅細(xì)胞可能發(fā)生自凝現(xiàn)象。因此，建議在反應(yīng)20 min后，隨時觀察反應(yīng)結(jié)果，摸索試驗終點時間，以便獲得最準(zhǔn)確結(jié)果，若紐扣狀沉淀較小或發(fā)現(xiàn)淚流狀流淌線細(xì)，可加長孵育時間。

7 結(jié)果的判定

（1） HA結(jié)果判定以紅細(xì)胞完全凝集的病毒最大稀釋度為抗原凝集價。

（2） 在陽性血清對照、抗原對照和1 %紅細(xì)胞對照完全正確情況下，將微量反應(yīng)板傾斜45°左右（不大于60°），孔底沉淀的紅細(xì)胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒的為凝集完全抑制，能完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋度為HI滴度。HI滴度的判定受主觀因素影響較大，判定時需要與對照孔進(jìn)行比對，與其淚滴大小、流速快慢一致的最后孔為其最終值。一般來說，以紅血球?qū)φ胀耆恋淼那昂? min內(nèi)判定試驗結(jié)果較好，大約在20 min～40 min左右。

8 小結(jié)

HA和HI試驗結(jié)果準(zhǔn)確與否，試驗中的每個因素都有單獨和綜合的影響。因此，試驗中一是要嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求操作，盡可能排除各種因素的影響或盡可能把影響降至最低，并在反復(fù)試驗的基礎(chǔ)上，固定試驗條件和判定時間，降低試驗誤差。否則就可能影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性或造成明顯偏離。二是要在反復(fù)實踐試驗的基礎(chǔ)上積累經(jīng)驗和掌握熟練的技術(shù)，方能保證HA與HI試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)而為科學(xué)防控重大動物疫病提供有力支持。