趙輝　張雨良　孔華　賈瑞宗　朱蕓　郭安平　曾會才　彭明

摘 要 為研究廣譜抗環(huán)斑病毒（PRSV）海南株系轉(zhuǎn)基因番木瓜育種方案，采集海南番木瓜各主要種植區(qū)的PRSV株系，以外殼蛋白（CP）、輔助成分-蛋白酶（HC-Pro）和復(fù)制酶（Nib）基因作為靶標(biāo)基因，通過序列比對和運用Clustalx軟件分析，得到干擾基因的保守區(qū)域和挑選出海南PRSV典型株系的代表樣品。以pUCCRNAi為骨架質(zhì)粒，利用代表樣品的CP、NIb、Hc-Pro基因片斷保守序列構(gòu)建RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)導(dǎo)入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表達載體，構(gòu)建出抗PRSV植物表達載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。實驗將PRSV不同株系保守序列的分析與RNAi的高效抗病設(shè)計理念相結(jié)合，可用于創(chuàng)造高效、廣譜抗PRSV病毒病的新種質(zhì)。

關(guān)鍵詞 番木瓜；番木瓜環(huán)斑病毒；RNA沉默；基因轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S432.41 文獻標(biāo)識碼 A

Construction of RNAi Plant Expression Vectors with Broad

Spectrum Resistance to Hainan Papaya Ringspot Virus

ZHAO Hui1，2， ZHANG Yuliang2 *， KONG Hua2， JIA Ruizong2， ZHU Yun3，4

GUO Anping2， ZENG Huicai2， PENG Ming2 **

1 Agriculture College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

3 Hawaii Agriculture Research Center， Hawaii 96797， USA

4 University of Hawaii， Hawaii 96822， USA

Abstract The PRSV strains of main papaya planting areas in Hainan were collected for breeding transformation papaya resistant to papaya ringspot virus. The conserved interference regions of target CP， Hc-Pro and Nib gene were analyzed and the typical representative sample strain of Hainan PRSV was selected among them by sequence alignment and by Clustalx software. On the basic of pUCCRNAi vector， the conserved regions of target genes of typical sample was PCRed to construct RNAi hairpin structures. Then the RNAi hairpin structures were jioned into the plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS. The broad spectrum PRSV resistant plant expression vector of pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS， pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS， pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS were constructed. Hanging the analysis of PRSV conservative sequence together with the design concept of RNAi high resistance， new germplasms with high efficient and broad virus resistant to Hainan PRSV could be created.

Key words Carica papaya； Papaya ringspot virus； RNA silencing； Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.017

番木瓜（Carica papaya）是世界第四大熱帶、亞熱帶暢銷水果，被世界衛(wèi)生組織列為最有營養(yǎng)價值的十大水果之首[1]。番木瓜生產(chǎn)上最大的限制因子是番木瓜環(huán)斑病毒病（papaya ringspot virus， PRSV），已經(jīng)被包括美國、南美、非洲、印度、泰國、臺灣、中國、菲律賓、墨西哥、澳大利亞、日本、法屬波利尼西亞、庫克群島等國家和地區(qū)確認(rèn)為毀滅性病害，造成番木瓜大量減產(chǎn)，甚至在有的地區(qū)造成100%的損失[2]。抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜已經(jīng)在美國夏威夷和佛羅里達，以及中國廣東商業(yè)化應(yīng)用，并取得了良好的抗病效果，但由于抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜序列同源性依賴的特性，限制了轉(zhuǎn)基因番木瓜在不同地理區(qū)域以外的應(yīng)用[3]。海南是中國最大的番木瓜生產(chǎn)地，由于番木瓜價格高，經(jīng)濟效益好，近年來海南番木瓜種植面積直線擴大，許多香蕉蕉園因香蕉枯萎病發(fā)生嚴(yán)重而改種了番木瓜，僅海南省香蕉主產(chǎn)區(qū)的樂東縣最高峰時番木瓜種植面積達到6 667 hm2，但由于PRSV的影響2011年已經(jīng)減少至2 667 hm2，2012年再減少一半變成1 333 hm2，至今海南仍沒有能抗番木瓜環(huán)斑病的栽培品種[1]。

目前，利用RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)化番木瓜得到轉(zhuǎn)基因種質(zhì)與品種（系）的研究國內(nèi)外尚未見報道。因此，本文利用抗PRSV有效的CP，Nib，Hc-pro基因片斷構(gòu)建單元或多元RNAi表達載體進行番木瓜轉(zhuǎn)化（或共轉(zhuǎn)化），將CP，Nib，Hc-pro基因保守序列分析與RNAi的高效抗病設(shè)計理念引入到番木瓜的抗病基因工程育種中，將獲得高效、廣譜抗PRSV的轉(zhuǎn)基因品種（系）。

1 材料與方法

1.1 材料

以感染PRSV代表樣品葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA[4]，用于目標(biāo)基因片斷PCR克隆；以pUCCRNAi為中間質(zhì)粒構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)，植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS為骨架質(zhì)粒，由CaMV 35S啟動子驅(qū)動，章魚堿合成酶基因的終止子（OCS 3′）終止，目標(biāo)基因正反向片段插入位點之間由長201 bp基因內(nèi)含子隔開。各種限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自北京全式金生物科技有限公司；引物由廣州立菲特生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 海南PRSV保守區(qū)域分析 在海南PRSV發(fā)生情況及分子鑒定的基礎(chǔ)上[4]，以PRSV病毒基因組CP、Hc-Pro和NIb作為靶標(biāo)基因，Blast比對GenBank數(shù)據(jù)庫中的PRSV核苷酸信息，通過序列比對和運用Clustalx軟件分析海南各株系間目標(biāo)基因的保守區(qū)域，同時挑選出最具典型的海南PRSV的CP、Hc-Pro和NIb基因的代表樣品。

1.2.2 海南PRSV CP、Hc-Pro和NIb基因保守區(qū)域干擾片段RNAi植物表達載體的構(gòu)建

（1）具有粘性末端保守區(qū)域正反片斷的獲得。依據(jù)樣品測序結(jié)果，找到CP、Hc-Pro和Nib為靶標(biāo)干擾基因的保守區(qū)域，設(shè)計特異性引物，用高保真Taq酶進行PCR反應(yīng)，在CP、Hc-Pro和NIb基因的正向片段分別引入XhoⅠ和BglⅡ酶切位點，在CP、Hc-Pro和NIb基因的反向片段分別引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，引物序列見下。

CP正向序列：酶切位點XhoⅠ和BglⅡ。

PRSV-CP-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGTCAACGC

CGGAACTAGTGGAACTT-3′

PRSV-CP-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTTCACGAG

CCCTATCAGGTGTCTTT-3′

基因大小544 bp。

CP反向序列：酶切位點SalⅠ和BamHⅠ。

PRSV-CP-RNAi-P3： 5′-GCGTCGACTCAACGC

CGGAACTAGTGGAACTT-3′

PRSV-CP-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCTCACGAG

CCCTATCAGGTGTCTTT-3′

Hc-Pro正向序列：酶切位點XhoⅠ和BglⅡ。

PRSV-Hcpro-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGTGAAT

GCACGTAACATGAACGA-3′

PRSV-Hcpro-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTACCAT

TTGCTGCCGAAACCTCT-3′

基因大小484 bp。

Hc-Pro反向序列：酶切位點SalⅠ和BamHⅠ。

PRSV-Hcpro-RNAi-P3： 5′-GCGTCGACTGAAT

GCACGTAACATGAACGA-3′

PRSV-Hcpro-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCACCAT

TTGCTGCCGAAACCTCT-3′

NIb正向序列：酶切位點XhoⅠ和BglⅡ。

PRSV-NIb-RNAi-P1： 5′-CCCTCGAGCTTTGTA

TTGCCATTCACCCAGAT-3′

PRSV-NIb-RNAi-P2： 5′-GAAGATCTACTCATC

CATAGAACCACGCTCAC-3′

基因大小424 bp。

NIb反向序列：酶切位點SalⅠ和BamHⅠ。

PRSV-NIb-RNAi-P3： 5′- GCGTCGACCTTTGT

ATTGCCATTCACCCAGAT-3′

PRSV-NIb-RNAi-P4： 5′-CGGGATCCACTCATC

CATAGAACCACGCTCAC-3′

PCR反應(yīng)體系25 μL，擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

在紫外燈下，切割RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京TianGen公司）回收目的基因片段。將其連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取3～5個陽性克隆送廣州立菲特公司測序。測序結(jié)果通過互聯(lián)網(wǎng)進行Blast比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi），確定與已知病毒序列的同源性。運行Clustalx（v1.83）軟件采用默認(rèn)參數(shù)進行序列比對。

（2）發(fā)夾干擾載體的構(gòu)建。將獲得的兩端帶有XhoⅠ和BglⅡ位點的CP、Hc-Pro和NIb干擾片段PCR產(chǎn)物亞克隆到pMD18-T simple上，用XhoⅠ和BglⅡ進行雙酶切，切下的片段連接到經(jīng)同樣雙酶切的pUCCRNAi干擾載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-Pro正、pUCCRNAi-NIb正。對這3個重組質(zhì)粒進行XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，確定正向片斷連接到pUCCRNAi載體上。

將CP、Hc-Pro和NIb基因反向干擾片段，用SalⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，切下的片段用T4連接酶連接到經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-pro正、pUCCRNAi-NIb正上，構(gòu)建成pUCCRNAi-CP正反、pUCCRNAi-Hc-pro正反、pUCCRNAi-NIb正反RNA中間干擾載體。將上述重組中間干擾載體，用SalⅠ和PstⅠ進行雙酶切鑒定。

用SalⅠ和PstⅠ雙酶切具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間干擾載體和植物表達載體，將發(fā)夾結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS，經(jīng)連接構(gòu)建成植物表達載體。將構(gòu)建好的番木瓜抗病毒植物表達載體pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS，用SalⅠ和PstⅠ進行雙酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南PRSV保守區(qū)域分析

海南各主要株系保守序列分析圖譜見圖1所示，通過前期工作，測序了海南主要番木瓜環(huán)斑病毒76個疑似病毒樣品，通過病毒序列比對，找到優(yōu)勢株系和共同保守區(qū)域的代表株系樣品HN21。由圖1中看出，代表樣品具有海南PRSV功能基因的共同保守區(qū)域特點，可作為設(shè)計海南PRSV CP、Hc-Pro和NIb基因廣譜抗病毒植物表達載體的模板。

代表樣品測序結(jié)果通過互聯(lián)網(wǎng)進行Blast比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi），結(jié)果海南番木瓜環(huán)斑病毒代表樣品中CP、Hc-Pro、NIb基因（其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3），與美國夏威夷轉(zhuǎn)基因木瓜病毒HA株系序列的同源性分別為90.20%、84.57%、84.25%，與臺灣轉(zhuǎn)基因木瓜病毒YK株系序列的同源性分別為92.65%、89.88%、92.18%。

2.2 具有粘性末端保守區(qū)域干擾片斷的獲得

帶有粘性末端的保守區(qū)域引物PCR擴增出的正反干擾片斷見圖2所示，通過圖2可看出，相關(guān)干擾片斷大小與引物設(shè)計時的一致，說明干擾片斷已被準(zhǔn)確擴增。

2.3 干擾片斷RNAi發(fā)夾結(jié)構(gòu)的獲得

將CP、Hc-Pro和Nib正向干擾片段用XhoⅠ和BglⅡ雙酶切后連接到pUCCRNAi干擾載體上，重組質(zhì)粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-Pro正、pUCCRNAi-NIb正，經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，分別切出與預(yù)期大小相一致的目的條帶（圖3），表明CP、Hc-Pro和NIb基因干擾片段已正向連到pUCCRNAi載體上。

反向干擾片段經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接到經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pUCCRNAi-CP正、pUCCRNAi-Hc-pro正、pUCCRNAi-NIb正上，重組正反向干擾載體經(jīng)SalⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖4，酶切片段與預(yù)期目的條帶大小一致，表明CP、Hc-Pro和NIb基因干擾片段已正反向連到pUCCRNAi載體上。

2.4 番木瓜抗病毒RNAi植物表達載體的獲得

構(gòu)建好的番木瓜抗病毒植物轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)見圖5。經(jīng)SalⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖6，酶切片段與預(yù)期目的條帶大小一致，表明CP、Hc-Pro和NIb基因干擾片段已正反向連到植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS上。

3 討論與結(jié)論

抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜是第一次實際應(yīng)用的抗病轉(zhuǎn)基因水果作物，在抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜中實際利用的抗病毒基因多來自病毒本身的基因，如病毒的外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因、核酶基因、輔助成分-蛋白酶基因等，其中外殼蛋白基因和復(fù)制酶基因的運用較為成功，輔助成分-蛋白酶基因的轉(zhuǎn)化研究是提高轉(zhuǎn)基因番木瓜抗病效果的重要研究方向。

大量實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番木瓜病毒抗性主要來自于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。臺灣研究者將番木瓜PLDMV病毒臺灣PTW-WF株系部分CP基因和PRSV臺灣YK株系部分CP基因構(gòu)建到同一載體轉(zhuǎn)化番木瓜，得到的轉(zhuǎn)基因植株能同時抗2種病毒，分子檢測實驗表明抗性植株的抗性主要來自轉(zhuǎn)錄后基因沉默[5]；為了得到抗福羅里達PRSV株系的轉(zhuǎn)基因品種，佛羅里達大學(xué)的研究者將當(dāng)?shù)貎?yōu)勢株系HIKCP基因的正義鏈、反義鏈、正義框架移動突變鏈、正義框架三聯(lián)終止子添加鏈同時轉(zhuǎn)化入雌性番木瓜中，病毒檢測實驗表明，4類轉(zhuǎn)基因植株都有抗PRSV效果，后三類病毒抗性轉(zhuǎn)基因植株無法翻譯病毒CP蛋白，但能在RNA水平上通過RNA沉默機制抵御PRSV的感染[6-8]。

研究結(jié)果表明，表達載體構(gòu)建的方式與基因沉默的效果有關(guān)。一般來說轉(zhuǎn)病毒單鏈正義或者反義基因賦予植物的病毒抗性只有20%左右，正反向重復(fù)目的基因被內(nèi)含子隔開時，其產(chǎn)生RNA沉默的效率最好，對病毒的抗性可高達90%[9]。張帆[10]等將PRSV CP基因的dsRNA載體pHG12-CPIR 分別轉(zhuǎn)入擬南芥、煙草和番木瓜中，RT-PCR檢測實驗顯示PRSV在野生型中有大量積累，而在轉(zhuǎn)基因植株中沒有積累。實驗表明與CP、Nib基因不同，將病毒的HC-Pro基因正鏈轉(zhuǎn)入寄主反而增強病毒的感染能力，不是理想的轉(zhuǎn)基因抗病機制。HC-Pro能夠強烈的局部干擾植物dsRNA前體形成siRNA或者是降低siRNA的穩(wěn)定性，是一個強烈的局部沉默抑制因子。利用dsRNA介導(dǎo)的RNA沉默抗病毒機制，楊國峰等[11]構(gòu)建了PRSV HC-Pro基因同源dsRNA的原核表達系統(tǒng)，并在番木瓜植株上噴灑dsRNA粗提液對番木瓜植株進行保護性處理和治療性處理，保護性處理能有效誘發(fā)對番木瓜環(huán)斑病毒的抗性，表現(xiàn)為發(fā)病率低，發(fā)病時間晚，治療性處理能在處理初期引起番木瓜環(huán)斑病毒積累量發(fā)生短暫降低。

發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達載體構(gòu)建的方式極大影響基因沉默的效果，比如目標(biāo)基因的選擇，基因沉默片斷的大小，發(fā)夾結(jié)構(gòu)內(nèi)含子的長短，轉(zhuǎn)基因片斷與沉默病毒的序列同源性等都與轉(zhuǎn)基因植物抗性相關(guān)。前人研究結(jié)果表明，構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)目標(biāo)基因片斷的長度在200～600 bp轉(zhuǎn)化后干擾效率最高，小于200 bp，大于600 bp效果不理想[12]，因此在理想范圍內(nèi)筆者選擇了400～600間的片斷進行克隆。近年來筆者對海南的PRSV病毒株系種類與分布在分子水平上進行了研究，進一步確認(rèn)了海南的三類PRSV類型 （HainanⅠ，HainanⅡ， andⅢ），三種類型的PRSV在海南不同城市間分布不同，由于受達爾文和非達爾文選擇的極大影響，海南PRSV具有極高的突變率[4]，因此在構(gòu)建發(fā)夾載體時從分析克隆海南株系共同保守區(qū)域片斷入手，使載體片斷與海南各株系有最大的同源性，以期解決廣譜抗病的問題。此外，為了分析同種病毒不同基因RNA介導(dǎo)的抗病毒效果，實驗選擇了3種抗PRSV較理想的基因（CP，Nib，Hc-Pro）片斷構(gòu)建載體。

RNA介導(dǎo)的抗性只需病毒RNA序列與靶序列同源，但當(dāng)轉(zhuǎn)基因序列和病毒基因序列的非同源性高于10%時，轉(zhuǎn)基因就很難賦予植物抗病性[13]，因而特異性更強，為了獲得廣譜的病毒抗性，通過附加更多的病毒相關(guān)序列擴充轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，能夠使轉(zhuǎn)基因植物獲得更為廣譜的抗性[14]。因此利用RNA 介導(dǎo)的抗性培育廣譜、高抗性的抗PRSV番木瓜新品系， 在理論上是可行的， 結(jié)果將在實際生產(chǎn)中具有十分重要的經(jīng)濟意義。

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