胡偉　顏彥　徐碧玉　金志強(qiáng)

摘 要 前期的研究發(fā)現(xiàn)MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實(shí)成熟密切相關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)MaGAD1表達(dá)的有效抑制劑氨氧乙酸（AOAA）能夠延緩香蕉采后成熟。生理學(xué)分析表明，外施AOAA能夠延長(zhǎng)香蕉果實(shí)發(fā)生生理躍變的時(shí)間。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，外施AOAA能夠抑制MaGAD1和MaACS1基因的表達(dá)。所以，AOAA通過(guò)抑制MaGAD1和MaACS1基因的表達(dá)和延緩香蕉果實(shí)生理躍變，推遲香蕉果實(shí)采后成熟。本研究從理論上證明AOAA能夠延緩香蕉果實(shí)成熟，揭示AOAA延緩香蕉果實(shí)成熟生理機(jī)制，并且從實(shí)際生產(chǎn)上提供一種可能應(yīng)用于香蕉保鮮的新方法。

關(guān)鍵詞 香蕉；采后成熟；乙烯；MaGAD1；AOAA

中圖分類(lèi)號(hào) Q344.13 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

香蕉是典型的呼吸躍變型果實(shí)，香蕉采后成熟過(guò)程中有大量的乙烯產(chǎn)生，從而導(dǎo)致一系列生理生化變化，如淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)樘?、多酚的降解、結(jié)構(gòu)碳水化合物的酶解。這些生理變化最終會(huì)導(dǎo)致香蕉品質(zhì)形成，如硬度、澀味、香味、顏色以及貨架期，進(jìn)而影響到香蕉的商品價(jià)值[1]。香蕉不易保鮮，不耐儲(chǔ)運(yùn)，運(yùn)銷(xiāo)中因腐爛造成的損失達(dá)總產(chǎn)量的20%以上[2]。因此，研究香蕉采后成熟機(jī)理，創(chuàng)新采后保鮮技術(shù)具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

谷氨酸脫羧酶（GAD）能夠與磷酸吡哆醛輔因子結(jié)合催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。GAD與植物pH調(diào)控、N儲(chǔ)存、植物發(fā)育、果實(shí)成熟等生理過(guò)程密切相關(guān)[3-4]。先前的研究從番茄、柑橘等果樹(shù)中分離出的GAD基因在果實(shí)成熟的不同階段具有差異表達(dá)的特征[5-7]。最近，Liu等[8]研究表明，隨著柑橘果實(shí)中可滴定酸含量的降低，CsGAD1基因的表達(dá)以及GAD活力顯著增加。所以，GAD基因的表達(dá)與果實(shí)的品質(zhì)也有一定的關(guān)系。氨氧乙酸（AOAA）和氨基脲被報(bào)道是GAD基因表達(dá)的抑制劑[9-12]。另外，AOAA被報(bào)道能夠抑制乙烯的產(chǎn)生。Bulantseva等[13]研究表明外施AOAA能夠?qū)е孪憬豆麑?shí)乙烯生物合成降低30%。然而，也有報(bào)道指出，AOAA與乙烯生物合成沒(méi)有關(guān)系，但與細(xì)胞內(nèi)亞精胺的水平密切相關(guān)[14]。

但是，AOAA和氨基脲是否能夠影響香蕉果實(shí)成熟尚不明確，AOAA和氨基脲影響果實(shí)成熟的生理機(jī)制尚不清楚。

筆者前期的研究利用抑制差減雜交及cDNA微陣列篩選香蕉采后乙烯躍變啟始時(shí)差異表達(dá)的基因。結(jié)果表明，GAD基因的cDNA片段顯著上調(diào)，并且是所獲得的289個(gè)cDNA片段中表達(dá)量最高的[15-16]。隨后，筆者克隆了該基因（MaGAD1），并測(cè)定了該基因在香蕉采后不同成熟階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明，MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實(shí)成熟密切相關(guān)[17]。本研究以MaGAD1為靶基因，篩選MaGAD1表達(dá)的抑制劑，探索MaGAD1表達(dá)的抑制劑對(duì)香蕉采后成熟的調(diào)控作用，揭示其作用的生理機(jī)制。這些研究結(jié)果不僅從理論上證明AOAA能夠促進(jìn)果實(shí)成熟及相關(guān)生理機(jī)制，并且從實(shí)際生產(chǎn)上提供一種能夠應(yīng)用于香蕉保鮮的新方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

供試香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）果實(shí)采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香蕉研究所澄邁香蕉種植基地。香蕉果實(shí)（斷蕾110 d后，全綠期，成熟度1），用0.1%次氯酸鈉消毒10 min，并用無(wú)菌水清洗3次。香蕉采后成熟過(guò)程劃分為7個(gè)成熟度：全綠期（成熟度1，Ⅰ），黃色出現(xiàn)期（成熟度2，Ⅱ），綠色多于黃色期（成熟度3，Ⅲ），黃色多于綠色期（成熟度4，Ⅳ），綠色輕微存在期（成熟度5，Ⅴ），全黃期（成熟度6，Ⅵ），全黃并有黑色斑點(diǎn)期（成熟度7，Ⅶ）[18]。

香蕉果實(shí)采后成熟抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)將香蕉果實(shí)分成3組（每組36個(gè)果指）：正常成熟、AOAA處理以及氨基脲處理。正常成熟：將香蕉果實(shí)放于25 ℃培養(yǎng)室，并統(tǒng)計(jì)達(dá)到成熟度7的時(shí)間。AOAA處理：將AOAA配成15、5、1 mmol/L 3個(gè)濃度梯度（每個(gè)濃度處理12個(gè)果指），每個(gè)濃度下再分5、30、120、240 min 4個(gè)時(shí)間浸泡香蕉果實(shí)（每個(gè)處理時(shí)間處理3個(gè)果指），然后將其放于25 ℃培養(yǎng)室，記錄每一組香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間。氨基脲處理：將氨基脲配成10、2、0.2 g/kg 3個(gè)濃度梯度（每個(gè)濃度處理12個(gè)果指），每個(gè)濃度下再分5、30、120、240 min（每個(gè)處理時(shí)間處理3個(gè)果指）4個(gè)時(shí)間浸泡香蕉果實(shí)，然后將其放于25 ℃培養(yǎng)室，記錄每一組香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間。每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù)。

AOAA處理實(shí)驗(yàn)將香蕉果實(shí)分成二組（每組21個(gè)果指）：正常成熟和AOAA處理。正常成熟：將香蕉果實(shí)放于25 ℃培養(yǎng)室，并記錄香蕉果實(shí)達(dá)到每一個(gè)成熟度的時(shí)間（每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)果指）。AOAA處理：用5 mmol/L AOAA處理香蕉果實(shí)240 min，將其放于25 ℃培養(yǎng)室，觀察記錄香蕉果實(shí)達(dá)到每一個(gè)成熟度的時(shí)間（每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)果指）。在正常成熟及AOAA處理下，取香蕉果肉測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)并進(jìn)行基因表達(dá)分析。每個(gè)樣品做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果實(shí)生理指標(biāo)的測(cè)定 香蕉果實(shí)硬度測(cè)定：根據(jù)杭州托普儀器有限公司硬度測(cè)定儀說(shuō)明書(shū)測(cè)定香蕉果實(shí)硬度。選取的測(cè)定部位為果實(shí)中間部位，每個(gè)果指測(cè)定3次，每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)果指。香蕉果實(shí)可溶性糖含量測(cè)定根據(jù)王學(xué)奎等[19]的方法。取3個(gè)香蕉果指，去除果皮，將果肉切成小塊，用液氮冷凍后壓碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用蒸餾水研磨，于沸水中連續(xù)提取兩次。提取液用苯酚和濃硫酸反應(yīng)后，在485 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)定3次。香蕉果實(shí)淀粉含量測(cè)定參照徐昌杰等[20]的方法。取3個(gè)香蕉果指，去除果皮，將果肉切成小塊，用液氮冷凍后壓碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用乙醇研磨，用80% Ca（NO3）2溶液提取2次。提取液用I2-KI反應(yīng)，于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸光度，每個(gè)樣品測(cè)定3次。

1.2.2 基因表達(dá)分析 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則，用primer premier 5設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1。在Stratagene的Mx3000P儀器上進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA ） 0.5 μL、5 μmol/L的一對(duì)引物各0.75 μL，cDNA樣品1 μL，然后用水補(bǔ)足至25 μL。每個(gè)樣品同時(shí)用于擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因MaActin1，并進(jìn)行3次重復(fù)。按照94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后做94～55 ℃的融解曲線分析。采用2-ΔΔCt定量方法進(jìn)行相對(duì)定量分析[21]，以0 d的cDNA模板為對(duì)照樣品。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAD基因抑制劑對(duì)香蕉采后成熟的影響

在正常成熟過(guò)程中，香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間為8 d。在15 mmol/L AOAA處理下，處理30、120、240 min后，香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間分別為10、11、12 d。在5 mmol/L AOAA處理下，處理30、120、240 min后，香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間分別為10、12、13 d。在1 mmol/L AOAA處理下，處理30、120、240 min后，香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度7的時(shí)間分別為9、12、12 d。這些結(jié)果表明，與正常成熟相比較，AOAA處理能夠推遲香蕉果實(shí)成熟，5 mmol/L AOAA處理240 min效果最為明顯（圖1-A）。而且，在5 mmol/L AOAA處理香蕉果實(shí)240 min，放置 8 d 后，香蕉果實(shí)幾乎沒(méi)有黑色斑點(diǎn)，而正常成熟的香蕉果實(shí)有較多的黑色斑點(diǎn)（圖1-C）。所以，外施AOAA能夠顯著推遲香蕉果實(shí)成熟。另外，10及0.2 g/kg氨基脲處理對(duì)香蕉果實(shí)成熟沒(méi)有推遲效果，2 g/kg氨基脲處理能夠輕微推遲香蕉果實(shí)成熟。這些結(jié)果表明，氨基脲處理對(duì)香蕉果實(shí)成熟的推遲效果不明顯（圖1-B）。

2.2 AOAA對(duì)香蕉采后成熟的影響

在5 mmol/L AOAA處理香蕉果實(shí)240 min后，觀察香蕉果實(shí)達(dá)到每一個(gè)成熟度的時(shí)間發(fā)現(xiàn)，除了成熟度1，AOAA處理后香蕉果實(shí)達(dá)到其它每一個(gè)成熟度的時(shí)間都比正常對(duì)照推遲（表2）。這些結(jié)果表明，外施AOAA能夠顯著推遲香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度2～7的時(shí)間。

2.3 AOAA對(duì)香蕉采后生理的影響

在正常成熟條件下，采后香蕉果實(shí)的硬度和淀粉在8～9 d急劇下降（圖2-A；2-B）；可溶性糖在采后8～9 d急劇上升（圖2-C）。這些結(jié)果表明，在正常成熟條件下，香蕉果實(shí)在8～9 d出現(xiàn)生理躍變。在AOAA處理?xiàng)l件下，采后香蕉果實(shí)的硬度和淀粉在8～18 d急劇下降（圖2-D；2-E）；可溶性糖在8～18 d急劇上升（圖2-F）。這些結(jié)果表明，在AOAA處理?xiàng)l件下，香蕉果實(shí)在8～18 d出現(xiàn)生理躍變。所以，在正常成熟及AOAA處理?xiàng)l件下，香蕉果實(shí)都從第8天開(kāi)始發(fā)生生理躍變；但是，與正常成熟相比較，AOAA處理下，香蕉果實(shí)發(fā)生生理躍變的時(shí)間顯著被延長(zhǎng)。

2.4 AOAA對(duì)香蕉采后乙烯生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

在正常成熟及AOAA處理?xiàng)l件下，MaACO1 的表達(dá)沒(méi)有明顯的規(guī)律；但是，MaGAD1和MaACS1的表達(dá)在香蕉采后0～7 d都維持在較低的水平，在采后第8顯著提高（圖3）。這些結(jié)果表明，MaGAD1和MaACS1的表達(dá)在香蕉采后成熟過(guò)程中具有一致的趨勢(shì)，并且在采后第8天顯著提高。另外，與正常成熟相比較，AOAA處理下MaGAD1和MaACS1的表達(dá)都顯著被抑制。

3 討論與結(jié)論

筆者們前期的研究發(fā)現(xiàn)，MaGAD1基因的表達(dá)與香蕉采后乙烯生物合成及果實(shí)成熟密切相關(guān)。本研究希望通過(guò)體外調(diào)控MaGAD1的表達(dá)，從而調(diào)控香蕉采后成熟過(guò)程。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AOAA和氨基脲能夠顯著抑制GAD基因的表達(dá)[9-12]。所以，用AOAA和氨基脲處理香蕉果實(shí)，統(tǒng)計(jì)香蕉果實(shí)在不同處理下達(dá)到成熟度7的時(shí)間，從而確定AOAA和氨基脲對(duì)香蕉果實(shí)采后成熟的影響。結(jié)果表明，AOAA能夠顯著推遲香蕉果實(shí)成熟。為了進(jìn)一步確證AOAA對(duì)采后香蕉果實(shí)成熟的延遲作用，筆者們統(tǒng)計(jì)了在AOAA處理下香蕉果實(shí)達(dá)到每一個(gè)成熟度的時(shí)間，結(jié)果表明AOAA能夠顯著推遲香蕉果實(shí)達(dá)到成熟度2～7的時(shí)間。這些結(jié)果充分的證明了AOAA能夠推遲采后香蕉果實(shí)成熟。

香蕉采后成熟過(guò)程經(jīng)歷了一系列的呼吸躍變過(guò)程，從而導(dǎo)致香蕉果實(shí)發(fā)生了相關(guān)的生理變化，如果實(shí)軟化[22]、淀粉降解和可溶性糖含量增加[23-24]。既然AOAA能夠顯著推遲香蕉果實(shí)采后成熟，那么是否AOAA能夠影響香蕉果實(shí)的生理變化值得進(jìn)一步探討。所以，在正常成熟和AOAA處理下測(cè)定了香蕉果實(shí)的硬度、淀粉含量和可溶性糖含量。結(jié)果表明，在正常成熟及AOAA處理下，香蕉果實(shí)都在采后第8天開(kāi)始生理躍變；但是，AOAA處理顯著延長(zhǎng)了香蕉果實(shí)發(fā)生生理躍變的時(shí)間。這些研究結(jié)果從生理學(xué)的角度支持了AOAA通過(guò)影響香蕉采后生理變化延緩香蕉果實(shí)成熟。

乙烯是香蕉采后成熟的重要調(diào)控因子。Liu等[25]研究表明，乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因MaACO1和MaACS1在香蕉采后成熟過(guò)程中起著重要作用。筆者們推測(cè)AOAA延緩香蕉采后成熟及生理躍變可能與MaACO1和MaACS1的表達(dá)密切相關(guān)。所以，筆者們研究了正常成熟及AOAA處理下香蕉果實(shí)MaACO1和MaACS1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在正常成熟及AOAA處理下香蕉果實(shí)MaACS1的表達(dá)水平在采后第8天顯著提高，與香蕉果實(shí)生理躍變發(fā)生時(shí)間一致。MaACS1被報(bào)道是香蕉采后成熟過(guò)程中躍變乙烯生物合成的關(guān)鍵酶基因[25-26]。綜上，這些研究結(jié)果從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步支持了AOAA通過(guò)影響MaACS1的表達(dá)延緩香蕉果實(shí)采后成熟。

本研究根據(jù)AOAA能夠顯著抑制GAD基因表達(dá)這一生理效應(yīng)，進(jìn)一步探討AOAA對(duì)香蕉采后成熟的影響，那么是否AOAA能夠抑制MaGAD1表達(dá)應(yīng)該得到證實(shí)。所以，筆者們測(cè)定了在正常成熟及AOAA處理下香蕉果實(shí)MaGAD1基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常成熟相比，AOAA能夠顯著抑制MaGAD1上調(diào)表達(dá)，同時(shí)也能抑制MaACS1上調(diào)表達(dá)（圖3）。另外，在正常成熟及AOAA處理下，MaGAD1表達(dá)與MaACS1表達(dá)的趨勢(shì)一致，并且都在采后第8天顯著上調(diào)，與香蕉果實(shí)生理躍變發(fā)生的時(shí)間一致（圖2、3）。綜上，本研究的結(jié)論是，AOAA通過(guò)抑制MaGAD1和MaACS1上調(diào)表達(dá)和延緩香蕉果實(shí)生理躍變，推遲香蕉果實(shí)采后成熟。

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