付崗　葉云峰　吳永官　杜嬋娟　晏衛(wèi)紅　潘連富

摘 要 為了收集利用香蕉炭疽病的生防菌資源和評價拮抗菌的防病能力，通過培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)和16S rRNA序列特征分析等方法對篩選到的7株拮抗菌進行鑒定，并對其防病作用進行了初步測試。結(jié)果表明：菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911為短短芽孢桿菌，菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌。人工接種結(jié)果表明，菌株Bc6301對香蕉炭疽病的防效最高，為45.94%，其余6株拮抗菌的防效在22.35%～43.29%。

關(guān)鍵詞 芭蕉炭疽菌；短短芽孢桿菌；蠟狀芽孢桿菌

中圖分類號 S436.67 文獻標(biāo)識碼 A

香蕉炭疽病由芭蕉炭疽菌[Colletotrichum musae（Berk. & Curt.）Arx]引起，是香蕉儲運過程中發(fā)生最為嚴(yán)重的病害之一[1]。由于重視程度不同和防治手段差異，由香蕉炭疽病導(dǎo)致的損失在20%～40%，嚴(yán)重時可達80%以上[2-3]。目前香蕉炭疽病的防治主要還是依靠化學(xué)藥劑，異菌脲、咪鮮胺、噻菌靈等生產(chǎn)上最常用的化學(xué)殺菌劑，由此帶來的農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為中國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素之一[4-5]。另外，由于長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥促使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，人們越來越重視尋求針對香蕉炭疽病的非化學(xué)防治途徑。

由于香蕉在采后儲運期間所處的環(huán)境條件相對較為穩(wěn)定，這給拮抗微生物的利用提供了有利條件。許多不同種類的拮抗菌被篩選用于防治香蕉炭疽病，其中以芽孢桿菌類（Bacillus sp.）細(xì)菌較為常見[6]?？莶菅挎邨U菌（B. subtillis）是最常見的香蕉炭疽病拮抗菌[7-9]。此外，也有利用解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等防治該病的報道[10]。雖然研究者們已篩選到相當(dāng)數(shù)量的拮抗微生物，但目前這些菌株尚未能應(yīng)用于生產(chǎn)。作者在前期研究中從廣西南寧不同作物根圍獲得的997株分離物中篩選到7株對香蕉炭疽病菌有較強抑菌作用的拮抗菌株，本文通過形態(tài)特征觀察、生理生化測試結(jié)合16S rRNA序列特征分析對這7株拮抗菌進行鑒定，并評價其對香蕉炭疽病的防治作用，旨在為香蕉炭疽病的生物防治提供新的菌種資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）Cm1和7株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911和Bc6301菌株均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所生物防治研究室提供。

供試香蕉：品種威廉斯（Musa AAA Cavendish var.Williams），采自廣西隆安縣丁當(dāng)鎮(zhèn)香蕉園，采收前2個月內(nèi)未噴施殺菌劑。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[5]和NA培養(yǎng)基[7]，分別用于培養(yǎng)香蕉炭疽病菌和拮抗菌。

分子生物學(xué)試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；Taq酶和dNTP購自北京百川開泰生物科技有限公司生產(chǎn)；引物F27和R1492由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形態(tài)和生理生化特征 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《一般細(xì)菌常用鑒定方法》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》觀察各菌株的培養(yǎng)形態(tài)、性狀、鞭毛和芽孢、革蘭氏染色，測定菌株的生理生化特征，觀察不同pH值、溫度條件下菌株的生長狀況及耐鹽性[11-13]。

1.2.2 拮抗菌的16S rRNA序列分析 參照說明書用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各拮抗菌株的DNA。采用細(xì)菌16S rRNA通用擴增引物Primer F27（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和Primer R1492（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序參照Fu等[7]的研究方法。

擴增產(chǎn)物電泳檢測后送上海生工生物公司，用引物Primer F27和R1492進行測序。測得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進行BLAST同源性比對，并利用Mega 6.06軟件采用鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果 7株拮抗菌分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃下 150 r/min搖床培養(yǎng)3 d，得到OD625=0.8的菌體發(fā)酵液。制備香蕉炭疽病菌孢子液濃度為104個/mL，備用。

田間采收八成熟的蕉果，去除傷病蕉果，將自然梳分成單個蕉指，抹去花器，洗凈晾干。蕉果在拮抗菌發(fā)酵液的10倍稀釋液中浸泡10 min后取出，室溫下晾干，以清水為對照。24 h后用Cm1孢子懸浮液對蕉果進行噴霧接種。再次晾干后，用厚度0.04 mm的聚乙烯袋密封包裝，然后放入紙箱，于27 ℃下，RH 78%放置貯藏。每個拮抗菌株3個重復(fù)，每重復(fù)8個蕉果。

共進行2次病情調(diào)查，實驗香蕉始發(fā)病時進行第1次調(diào)查，香蕉完全成熟后進行第2次調(diào)查；參照Fu等的標(biāo)準(zhǔn)進行病情分級[7]。拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果的計算公式為：病情指數(shù)=[100×∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)值）]/（調(diào)查總果數(shù)×9）；防治效果/%=100×（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)。

1.2.4 拮抗菌株Bc6301對香蕉炭疽病菌的抑制作用

按1.2.3方法制備Bc6301的菌體發(fā)酵液和香蕉炭疽病菌Cm1菌株的孢子液。將拮抗菌發(fā)酵液通過0.22 μm細(xì)菌過濾器獲得無菌濾液，與Cm1菌株孢子液等量混合后，置凹玻片28 ℃共培養(yǎng)。以等量無菌水與Cm1孢子液混合為對照，24 h后鏡檢病菌孢子生長萌發(fā)情況。每次隨機選取3個視野，計數(shù)視野內(nèi)可見的所有孢子，芽管長度大于孢子長度1/2的計為孢子萌發(fā)。每處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SAS9.0軟件進行分析，采用Duncan's新復(fù)極差法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

拮抗菌在NA平板上培養(yǎng)16 h后，陸續(xù)出現(xiàn)單菌落。菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911的形態(tài)特征較為一致，單菌落為圓形、有光澤、不透明，中間隆起，邊緣整齊（圖1-A）。電子顯微鏡下可見菌體呈短桿狀，產(chǎn)芽孢，具周生鞭毛（圖1-B）。

菌株Bc6301的單菌落乳白色、粘稠厚重、半透明、濕潤光亮，表面似毛玻璃或蠟狀（圖1-C）。菌體呈桿狀，鞭毛周生較稀疏（圖1-D）。

2.2 菌株的生理生化特征

7株拮抗菌的生理生化反應(yīng)測試結(jié)果見表1。Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911等6菌株的測試反應(yīng)結(jié)果類似，其中12項生理生化測試及其生長溫度和pH值測試結(jié)果完全一致，并與細(xì)菌分類學(xué)專著[11-13]中對短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的描述相符。B. brevis的硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用和2% NaCl生長這3項測試反應(yīng)在《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的描述為結(jié)果可變。表1的結(jié)果顯示，以上6株拮抗菌之間在這3項反應(yīng)上確有細(xì)微差異。

與前述6株拮抗菌相比，菌株Bc6301的生理生化反應(yīng)結(jié)果差異較大。如，在V-P反應(yīng)、硫化氫產(chǎn)生、淀粉水解、卵磷脂酶、厭氧生長等方面都呈現(xiàn)不同反應(yīng)。根據(jù)各菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)合其形態(tài)特征，參照細(xì)菌分類學(xué)專著[11-13]，可初步確定菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 菌株的16S rRNA序列特征

經(jīng)基因組DNA提取，對7株拮抗菌的16S rRNA區(qū)段進行PCR擴增，均得到大小約1.5 kb的擴增產(chǎn)物。7份PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分別得到1 402～1 459 bp的堿基序列，所有序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，并獲得了各自的登錄號，結(jié)果如表2所示。各序列與GenBank中已有序列的Blast比對結(jié)果顯示，菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的16S rRNA序列的同源性最高，達100%；其余6菌株的相應(yīng)序列均與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的同源性最高，為99%。

以Agrobacterium rhizogenes（FJ527681）為外群，構(gòu)建了菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911與相關(guān)24個細(xì)菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，這6株拮抗菌與其它4株短短芽孢桿菌（EU771078、GQ375794、EF488102、AY591911）共同聚集在同一個小的分支內(nèi)，包括這個分支在內(nèi)的所有短芽孢桿菌屬的菌株均處于同一個大的分支中。而芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的菌株（EU257435）處于距離較遠的分支。說明這6株拮抗菌與短芽孢桿菌屬的短短芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近（圖2）。

以Xanthomonas cynarae（AF208315）為外群，構(gòu)建的菌株Bc6301與GenBank數(shù)據(jù)庫中21個相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。從圖中可以看出，菌株Bc6301與所有芽孢桿菌屬的細(xì)菌處于同一個大的分支，并與3株蠟狀芽孢桿菌（HM026606、FJ908707、GU812900）處于同一個較小分支內(nèi)，顯示菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。

2.4 拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果

7株拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果見表3。香蕉貯藏16 d開始發(fā)病，各處理病情指數(shù)在15.42～26.78；從防效看，蠟狀芽孢桿菌Bc6301的防效最高，為71.24%，6株短短芽孢桿菌的防效在50.06%～65.74%。貯藏至19 d香蕉完全成熟，各處理區(qū)的病情指數(shù)均有增長，防效均有所降低，但Bc6301菌株的防效（68.24%）仍明顯高與其它菌株。6株短短芽孢桿菌防效最高者為菌株Bb7802和Bb7304，分別為63.72%和61.59%。

2.5 拮抗菌Bc6301對香蕉炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

鏡檢可見菌株Bc6301對香蕉炭疽病菌的孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。清水對照的病菌孢子萌發(fā)率可達84.4%，而經(jīng)拮抗菌發(fā)酵液處理的病菌孢子萌發(fā)率僅為36.8%，并且孢子芽管較短。但未觀察到孢子畸形或原生質(zhì)泄露現(xiàn)象（圖4）。

3 討論與結(jié)論

通過對各菌株的形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)的測定，參照分類學(xué)專著并結(jié)合菌株16S rRNA序列特征的分析，將6株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），將菌株Bc6301鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

短短芽孢桿菌作為其它植物病害生防菌的研究國內(nèi)外已有相關(guān)報道，其防治對象有煙草青枯病[14]、柑橘炭疽病[15]、萵苣菌核病[16]、草莓灰霉病[17]、番茄枯萎病[18]、黃瓜枯萎病[19]、瓜類枯萎病[20]、蔬菜猝倒病[21]和棉花枯黃萎病[22]等，但至今尚未見利用短短芽孢桿菌防治香蕉炭疽病的報道。

蠟狀芽孢桿菌作為植物病害生防菌已報道的防治對象有棉花黃萎病[23]、黃瓜枯萎病[24]、草莓白粉病[25]、小麥全蝕病[26]、植物青枯病[27]等。但未見蠟狀芽孢桿菌用于防治香蕉炭疽病。本研究進一步擴展了短短芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌作為生防菌的抗病譜，也進一步擴充了香蕉炭疽病生防菌的資源庫，為下一步香蕉炭疽病的生物防治提供了菌種材料。

對香蕉炭疽病的防效測試結(jié)果表明，香蕉貯藏16 d，7株拮抗菌的最高防效為71.24%，至蕉果完全成熟時，仍有3株拮抗菌的防效在61.59%以上。本研究中拮抗菌的培養(yǎng)是按照普通細(xì)菌的培養(yǎng)方式進行，而實際上，若針對某一特定的拮抗菌株采用與之相適應(yīng)的最佳培養(yǎng)條件，并輔以合適的助劑，其防病效果還將有所提升。也就是說這些拮抗菌仍存在較大的生防潛能有待開發(fā)，這也是今后需要進一步研究的內(nèi)容。

參考文獻

[1] Natáliaa R P， Eiko E K， Mário S C D， et al. Identification and characterization of Colletotrichum spp. affecting fruit after harvest in Brazil[J]. Journal of Phytopathology， 2002， 150（3）：128-134.

[2] Alvindia D G， Kobayashi T， Yaguchi Y， et al. Symptoms and the associated fungi of postharvest diseases on nonchemical bananas imported from the Philippines[J]. Japanese Journal of Tropical Agriculture， 2000（4）： 87-93.

[3] Chillet M， Hubert O， Rives M J， et al. Effects of the physiological age of bananas on their susceptibility to wound anthracnose due to Colletotrichum musae[J]. Plant Disease， 2006， 90（9）： 1 181-1 185.

[4] Krauss U， Johanson A. Recent advances in the control of crown rot of banana in the Windward Islands[J]. Crop Protection， 2000， 19（3）： 151-160.

[5] 付 崗， 黃思良， 謝 玲， 等. 45%咪鮮胺水乳劑對香蕉采后炭疽病的控制效果[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（23）： 11 056-11 057.

[6] 劉曉妹， 蒲金基， 唐秋榕. B05菌株抗菌譜及對幾種香蕉病害防效的測定[J]. 中國南方果樹， 2006， 35（6）： 41-46.

[7] Fu G， Huang S L， Ye Y F， et al. Characterization of a bacterial biocontrol strain B106 and its efficacy in controlling banana leaf spot and post-harvest anthracnose diseases[J]. Biological Control， 2010， 55（1）： 1-10.

[8] 何 紅， 蔡學(xué)清， 陳玉森， 等. 辣椒內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2002， 31（4）： 442-444.

[9] 譚志瓊， 淦國英， 張榮意. 枯草芽孢桿菌B68對香蕉果實潛伏炭疽菌的抑制作用[J]. 廣西熱帶農(nóng)業(yè)， 2006， 5（10）： 1-3.

[10] Alvindia D G， Natsuaki K T. Biocontrol activities of Bacillus amyloliquefaciens DGA14 isolated from banana fruit surface against banana crown rot-causing pathogens[J]. Crop Protection， 2009， 28（3）： 236-242.

[11] 東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001.

[12] 中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組. 一般細(xì)菌常用鑒定方法[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1978.

[13] 布坎南， 吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1984.

[14] 易有金， 尹華群， 羅 寬， 等. 煙草內(nèi)生短短芽孢桿菌的分離鑒定及對煙草青枯病的防效[J]. 植物病理學(xué)報， 2007， 37（3）： 301-306.

[15] 汪 茜， 胡春錦， 柯仿鋼， 等. 生防菌株1404的鑒定及其對采后柑橘炭疽病的防治效果[J]. 微生物學(xué)報， 2010， 50（9）： 1 208-1 217.

[16] Hwang J Y， Shim C K， Ryu K Y， et al. Selection of Brevibacillus brevis B23 and Bacillus stearothermophilus B42 as biological control agents against sclerotinia rot of lettuce[J]. Research in Plant Disease， 2006， 12（3）： 254-259.

[17] Haggag W M. Isolation of bioactive antibiotic peptides from Bacillus brevis and Bacillus polymyxa against Botrytis grey mould in strawberry[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection， 2008， 41（7）： 477-491.

[18] Sunita C， Eunice J A， Steve W. Biological control of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici on tomato by Brevibacillus brevis[J]. Journal of Phytopathology， 2010， 158（7-8）： 470-478.

[19] 張 璐， 丁延芹， 杜秉海， 等. 黃瓜枯萎病病原拮抗細(xì)菌DS-1菌株鑒定及其生防效果研究[J]. 園藝學(xué)報， 2010， 37（4）： 575-580.

[20] 車建美， 劉 波， 藍江林. 短短芽孢桿菌JK-2的GFP標(biāo)記及其抑菌作用[J]. 中國生物防治， 2010， 26（2）： 230-234.

[21] Walker R， Powell A A， Seddon B. Brevibaeillus isolates from the spermosphere of peas and dwarf French beans with antifungal activity against Botrytis cinerea and Pythium species[J]. Journal of Applied Microbiolog， 1998（84）： 791-801.

[22] 陳 莉， 繆衛(wèi)國， 劉海洋， 等. 短短芽孢桿菌A57菌株對棉花主要病原真菌的拮抗作用及其最佳液體發(fā)酵條件[J]. 中國生物防治， 2007， 23（增刊）： 22-27.

[23] 張洪濤， 于頻頻， 艾山江· 阿布都拉， 等. 棉花黃萎病高效拮抗菌XJUL-6的篩選鑒定及其特性研究[J]. 微生物學(xué)報， 2007， 47（6）： 1 084-1 087.

[24] 郝變青， 馬利平， 喬雄梧， 等. 芽孢桿菌BC98-Ι拮抗蛋白性質(zhì)及其對黃瓜枯萎病菌的抑菌作用[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2004， 22（增刊）： 91-94.

[25] 陳 沖， 王程亮， 張潞生. 蠟狀芽孢桿菌TS-02防治草莓白粉病研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（11）： 3 298-3 299.

[26] Han Y X， Hu B J， Wang G N. Control efficacy and antifungal mechanism of Bacillus cereus strain JK14 against wheat take-all disease[J]. Agricultural Science & Technology， 2008（9）： 70-74.

[27] 車建美， 劉 波， 張 彥， 等. 青枯病生防菌蠟狀芽孢桿菌（ANTI-8098A）的綠色熒光蛋白基因（gfp）轉(zhuǎn)導(dǎo)及其生物學(xué)特性的變化[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2010， 18（2）： 337-345.