錢雙宏　沈林波　熊國如　王俊剛　馮翠蓮　趙婷婷　張樹珍

摘 要 針對(duì)海南省不同植蔗區(qū)甘蔗褐條病的典型病斑進(jìn)行分離培養(yǎng)、單孢純化、形態(tài)學(xué)觀察、致病性檢測(cè)以及結(jié)合rDNA-ITS序列分析鑒定病原菌。分離到的5株病原菌，經(jīng)回接實(shí)驗(yàn)表明，病原菌HT-4致病性最強(qiáng)，能引起與田間病害一致的癥狀，將菌株HT-4的rDNA-ITS序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明：菌株HT-4與離蠕孢屬（Bipolaris）相似性達(dá)到99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析確定該菌是甘蔗褐條病的病原菌。室內(nèi)毒力實(shí)驗(yàn)表明：在7種供試藥劑中，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡种菩Ч詈?，EC50值分別為4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L。結(jié)果為甘蔗褐條病的防控提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞 甘蔗褐條??；離蠕孢屬；室內(nèi)毒力測(cè)定；殺菌劑

中圖分類號(hào) S435.661 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

世界上已知甘蔗病害有130多種，國內(nèi)記載有60多種，其中，侵染性病害包括真菌性病害29種，細(xì)菌性病害5種，病毒和植原體病害8種，線蟲病害8種，寄生性植物2種，其余為非侵染性病害[1-2]。甘蔗褐條病是為害甘蔗葉片的一種真菌性病害[3]。其病原菌的有性階段為子囊菌門旋孢腔菌屬狹斑旋孢腔菌[Cochliobolus stenospilus（Drechs）Mats et Yam.]，目前甘蔗褐條病的有性階段僅在人工培養(yǎng)基或少數(shù)地方（如中國臺(tái)灣）發(fā)現(xiàn)過[4]；無性階段為半知菌類離蠕孢屬甘蔗狹斑離蠕孢菌[Bipolaris stenospila（Drechs）Shoemaker（=Helminthosporilum stenospilum Drechsler.）][5]。甘蔗褐條病于1924年首次在古巴發(fā)現(xiàn)[6]，至今已有許多國家都有此病害發(fā)生的報(bào)道。在中國各地蔗區(qū)如海南、廣東、廣西、云南、江西、福建、四川等?。ㄗ灾螀^(qū)）目前均有發(fā)生[5，7]。據(jù)報(bào)道，1975年曾在海南省定安縣龍門坡發(fā)生了較嚴(yán)重的褐條病，感病蔗株葉片早枯、植株矮小，甘蔗正常生長受到影響[6]。前人關(guān)于甘蔗褐條病在各植蔗區(qū)流行與防治、病原菌分類以及其致病毒素等方面的研究已有相關(guān)報(bào)道[8-13]。迄今，中國對(duì)甘蔗褐條病研究還較少，主要局限在病害發(fā)生原因、特點(diǎn)及防治措施的研究，而關(guān)于甘蔗褐條病病原菌鑒定還未見報(bào)道。近年來由于單一甘蔗品種的大面積連作種植，缺乏相應(yīng)的抗病品種，導(dǎo)致甘蔗褐條病頻發(fā)和大面積爆發(fā)，影響甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，本研究通過對(duì)甘蔗褐條病進(jìn)行分離鑒定及對(duì)其進(jìn)行殺菌劑室內(nèi)毒力的測(cè)定，擬為甘蔗褐條病病害防治策略制定以及進(jìn)一步培育甘蔗抗病品種提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘蔗病害樣本分別取自海南省?？?、臨高、澄邁、文昌、屯昌、白沙、昌江和定安等植蔗區(qū)，取生長健壯的甘蔗植株在實(shí)驗(yàn)室大棚中盆栽待用。

供試藥劑：50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（江門市大光明農(nóng)化有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；50%多菌靈可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；75%百菌清可濕性粉劑（上海亞泰農(nóng)資有限公司）；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；65%代森鋅可濕性粉劑（上?；莨饣瘜W(xué)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 用常規(guī)組織分離法[14]分離病原菌。從蔗區(qū)采集表現(xiàn)甘蔗褐條病典型癥狀的新鮮病葉，用自來水沖洗干凈葉片表面，晾干。將病健交界處用手術(shù)刀片切成小塊病組織（0.5 cm2），然后在超凈工作臺(tái)中，用70%酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液中消毒1 min，然后用無菌水清洗3次，置于無菌的濾紙上晾干。將病組織塊放入含氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

待菌落長出后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)。產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢純化[15]，觀察形態(tài)特征并根據(jù)孢子形態(tài)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 病原菌致病性鑒定 將單孢菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長出孢子后，用無菌水制成孢子懸浮液，將其稀釋成孢子濃度為1×106個(gè)/mL。采用噴霧法，對(duì)健康甘蔗葉片接種（噴無菌水作為對(duì)照），套袋保濕24 h，10 d后觀察其發(fā)病癥狀是否與田間癥狀一致，并從發(fā)病部位進(jìn)行病原菌分離，觀察孢子的形態(tài)特征與原分離菌株的形態(tài)特征是否相同。

1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 參照陳吉良等[16]的方法快速高效提取病原菌DNA。引物為真菌通用引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10×PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 1.6 μL，ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板1.5 uL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 室內(nèi)毒力的測(cè)定 采用菌絲生長速率測(cè)定法[17-18]，測(cè)定7種農(nóng)藥對(duì)甘蔗褐條病病原菌的毒力。7種農(nóng)藥藥劑都配制成10 g/L的母液，然后分別用無菌水在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上配置成5個(gè)濃度梯度的藥液，將每種藥劑不同稀釋度的藥液分別加入冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平板，以無菌水為對(duì)照。將甘蔗褐條病病原菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)6 d。用滅菌的打孔器（內(nèi)徑6 mm）在培養(yǎng)好的褐條病菌菌落邊緣打取菌餅。將菌餅分別移到含藥平板中央，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑制率=×100%

根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算表，將抑制百分率換算成抑制機(jī)率值。用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以處理濃度（mg/L）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)抑制機(jī)率值為縱坐標(biāo)求出毒力回歸方程，并求出抑制中濃度EC50、EC95和相關(guān)系數(shù)（R）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀和形態(tài)學(xué)鑒定

病菌先侵害嫩葉，早期癥狀呈透明水漬狀小點(diǎn)，長約0.5 mm，隨后病斑沿主脈平行擴(kuò)展成水漬狀黃色條斑。隨后黃色條斑中央出現(xiàn)紅色小點(diǎn)，整個(gè)病斑變?yōu)榧t褐色，周圍狹窄有黃色暈圈，成熟的病斑一般長2～25 mm，有的甚至長達(dá)50～75 mm，寬為2～4 mm（圖1-A）。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，條斑聯(lián)合成大斑塊，全葉變?yōu)榧t色；病斑輪廓不明顯，病葉提早干枯，植株青葉少，導(dǎo)致病株矮小。

從甘蔗病組織中共分離獲得5株菌株，編號(hào)為HT1～5。這些菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，灰綠色或淡褐色，邊緣菌絲呈灰白色，棉絮狀，邊緣菌絲較稀?。▓D2-A）。鏡檢觀察到分離物菌絲發(fā)達(dá)，分枝繁茂和分生孢子梗淡褐色（圖2-C，D），分生孢子呈橄欖綠色或淡褐色，近紡錘形或長橢圓形，微彎，具有3～11個(gè)隔膜，一般7～8個(gè)隔膜（圖2-B），與楊子林等[3]的報(bào)道一致。

2.2 病原菌致病性鑒定

用噴霧法將純化的菌株回接到健康甘蔗植株上，接種5 d后開始發(fā)病，癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同（圖1-B）。從發(fā)病植株上再分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，表明所分離到的病原菌是甘蔗褐條病的病原菌。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)致病性最強(qiáng)的菌株HT-4（KM494989）進(jìn)行PCR擴(kuò)增其rDNA-ITS序列（圖3），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，目的片段長度為592 bp，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株HT-4與離蠕孢屬（Bipolaris）相似性達(dá)到99%。然后利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所分離到的病原菌與Bipolaris setariae strain CBSHN01（GU290228.1）處于同一個(gè)分支，進(jìn)化上的距離最近，根據(jù)上述病原菌的形態(tài)特征以及rDNA-ITS序列同源性比較的結(jié)果，表明菌株HT-4是甘蔗褐條病的病原菌。

2.4 不同藥劑對(duì)甘蔗褐條病病原菌的抑制作用

7種供試藥劑對(duì)甘蔗褐條病病原菌室內(nèi)毒力測(cè)定的結(jié)果（表1）表明，7種供試藥劑對(duì)甘蔗褐條病病原菌均有一定的抑制作用。其中，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡种谱饔眯Ч詈?，EC50值分別為4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L；其次是75%百菌清和70%代森錳鋅，EC50值分別為63.242 0 mg/L和37.068 1 mg/L；而65%代森鋅、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈抑制效果相對(duì)較差，EC50值分別為196.594 5、256.573 3、543.184 8 mg/L。在7種供試的殺菌劑中，50%咪鮮胺錳鹽的EC95值最小，為20.406 8 mg/L；其次是10%苯醚甲環(huán)唑其EC95值為49.155 6 mg/L。而70%代森錳鋅、75%百菌清、65%代森鋅、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈EC95值均高于200 mg/L，分別為291.164 2、1 039.747 4、1 595.173 9、3 156.974 3、4 207.156 4 mg/L。說明不同的供試藥劑對(duì)甘蔗褐條病菌的毒力存在較大差異。根據(jù)毒力回歸方程斜率值可判斷病菌對(duì)藥劑濃度變化的敏感性，斜率值越大說明病原菌對(duì)藥劑的敏感性越強(qiáng)，即：在7種殺菌劑中，甘蔗褐條病菌對(duì)50%咪鮮胺錳鹽最敏感。

3 討論與結(jié)論

離孺孢屬是自然界中分布廣泛的一類真菌，可引起禾本科作物及雜草的嚴(yán)重病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也能引起作物發(fā)生根腐病[19-20]，如玉米小斑病[21]、稻胡麻葉斑病[22]、小麥根腐病[23]等。甘蔗褐條病菌人工接種可侵染一些禾本科雜草，在自然界中除甘蔗外，還沒有在其他植物上發(fā)現(xiàn)[5]。目前，關(guān)于甘蔗褐條病的研究，僅有楊子林等[3]、陳庭俊[8]、李秋陽等[12]對(duì)甘蔗褐條病的發(fā)生原因、特點(diǎn)及防治措施進(jìn)行了報(bào)道，而關(guān)于甘蔗褐條病菌的分離、鑒定及其致病機(jī)理還未見報(bào)道。本研究從甘蔗病株上分離到5株菌株，通過致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)在分離到的5株菌株中，菌株HT-4的致病力最強(qiáng)，接種健康甘蔗葉片后發(fā)病速度快，并且接種植株的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，對(duì)回接葉片的病斑進(jìn)行再分離，仍然分離到形態(tài)一致的菌株。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析，確定菌株HT-4是引起甘蔗褐條病的病原菌。所分離到菌株與前人報(bào)道的甘蔗褐條病菌Bipolaris stenospila（AB179837.1）的rDNA-ITS序列存在一定的差異，推測(cè)不同菌株間可能存在遺傳多樣性。

由于分類系統(tǒng)的復(fù)雜性以及病原菌存在生理小種和多樣性，導(dǎo)致在病原菌的判定上存在一定的混淆，如甘蔗褐條病早期癥狀和孢子形狀大小均與甘蔗眼斑病相似，但兩者在成長斑上存在不同，甘蔗褐條病病斑沒有向葉尖產(chǎn)生與葉脈平行的壞死條紋[24-25]。

藥劑篩選試驗(yàn)表明，7種藥劑對(duì)甘蔗褐條病菌都有一定抑制效果，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)υ摼囊种浦袧舛让黠@低于其它5種藥劑。目前農(nóng)業(yè)上多用多菌靈和甲基硫菌靈來防治該病害[5，12]，而本研究結(jié)果表明，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑明顯比多菌靈和甲基硫菌靈的毒力更強(qiáng)，推測(cè)可能是由于長期使用多菌靈和甲基硫菌靈導(dǎo)致甘蔗褐條病菌對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性或不同地區(qū)甘蔗褐條病菌對(duì)藥劑的敏感性不同。因此，篩選防治甘蔗褐條病的有效藥劑，需進(jìn)行藥劑的田間試驗(yàn)來驗(yàn)證，找出安全、經(jīng)濟(jì)有效的藥劑來減少藥劑用量、降低環(huán)境污染和防止病原菌產(chǎn)生抗藥性。

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