龍德彪等

摘要[目的] 研究睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠性行為及精子活性的影響。[方法] 用輕柔刺激法睡眠剝奪昆明雄性小鼠36 h，觀察其性行為，通過(guò)鏡檢計(jì)算精子活率和精子畸變率。 [結(jié)果] 36 h 睡眠剝奪后，捕捉潛伏期極顯著升高（P<001），捕捉次數(shù)極顯著降低（P<001）。36 h睡眠剝奪后精子活率顯著降低（P<0.05），精子畸變率極顯著升高（P<0.01）。[結(jié)論] 36 h睡眠剝奪可對(duì)雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量產(chǎn)生明顯不良影響。

關(guān)鍵詞睡眠剝奪；捕捉次數(shù)；捕捉潛伏期；精子活率；精子畸變率

中圖分類號(hào)S865.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）24-106-02

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多的人受到不斷增加的工作和生活壓力，不同職業(yè)的人都可能處于不同程度的睡眠剝奪（Sleep deprivation，SD）狀態(tài)。研究表明，睡眠剝奪影響機(jī)體的代謝、免疫系統(tǒng)、應(yīng)激及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面，與人體的各種疾病如心血管疾病，肥胖癥，精神焦慮，抑郁癥等的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]。被動(dòng)的睡眠剝奪已經(jīng)成為日益突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問(wèn)題。

目前，有關(guān)睡眠剝奪導(dǎo)致的雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的研究較為少見(jiàn)。研究表明，72 h的睡眠剝奪會(huì)造成雄性小鼠性行為異常和生殖系統(tǒng)的不良影響[4-5]，還有研究表明對(duì)小鼠進(jìn)行一定時(shí)間的睡眠剝奪后可引起雄性小鼠的生殖毒性效應(yīng)[6]。但是，中等時(shí)長(zhǎng)（如36 h）的睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠性行為及精子活力的影響仍缺乏深入明確的認(rèn)識(shí)。筆者采用輕微改良的輕柔刺激法研究36 h睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的影響，以睡眠剝奪后捕捉次數(shù)、捕捉潛伏期、精子活率和精子畸變率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在為睡眠剝奪影響雄性動(dòng)物生殖行為及精子質(zhì)量提供理論參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取雄性昆明小鼠24只，體重（26±4）g，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，12 h光照、12 h黑暗處理，室溫為（25±5）℃，所有小鼠均正常取食與給水。將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成2組，每組12只，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)分組

采用改良的輕柔刺激法[7]，實(shí)驗(yàn)人員輪流值班，拍打小鼠籠發(fā)出聲音，從而使小鼠不能進(jìn)入睡眠狀態(tài)。如果小鼠長(zhǎng)時(shí)間不睡眠而陷入不活躍狀態(tài)，則用棍狀物直接刺激小鼠使其無(wú)法進(jìn)入睡眠。對(duì)照組，不作睡眠剝奪（SD）處理；試驗(yàn)組，第1天8：00到次日20：00SD處理36 h；正常飼喂與飲水。

1.3方法

1.3.1小鼠性行為。36 h SD處理后，保持實(shí)驗(yàn)室安靜，將處理組和對(duì)照組的成熟雄性小鼠放入290 mm×178 mm ×160 mm的鼠籠中適應(yīng)5 min，接著與2只同批飼養(yǎng)的成熟雌性小鼠形成1∶2配對(duì)，觀察30 min。觀察指標(biāo)包括：①捕捉潛伏期（Capture incubation period，CIP）：計(jì)算雌鼠投入到鼠籠直到雄鼠第1次捕捉雌鼠的時(shí)間。②捕捉次數(shù)（Capture times，CT）：自雌鼠投入到鼠籠開(kāi)始，雄鼠撲捉雌鼠的動(dòng)作，主要是爬背或添陰動(dòng)作次數(shù)。

1.3.2精子活率。解剖小鼠后，將任意一側(cè)附睪用剪刀剪碎，然后放入1 ml的0.86%生理鹽水中，生理鹽水需要預(yù)熱至37 ℃，再水浴10 min，制成精子懸液。取1滴懸液，滴于載玻片，在顯微鏡（100×）暗視野下觀察，共觀察200個(gè)精子，使用計(jì)數(shù)器手動(dòng)記錄下精子運(yùn)動(dòng)情況。將精子活力依據(jù)文獻(xiàn)分級(jí)：A.快速直線向前；B.慢速直線向前或轉(zhuǎn)動(dòng)向前；C.原地顫動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)；D.不活動(dòng)。精子活率=A+B+C /A+B+C+D[8]。

1.3.3精子畸變率。取“1.3.2”的精子懸浮液進(jìn)行涂片，玻片干燥后用甲醇固定5 min。干后用2%伊紅（Eosin）水溶液染色1 h[9]。檢查精子形態(tài)，每只小鼠檢查完整的精子1 000條。

1.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，首先對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布和方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果以± SE表示。

2結(jié)果與分析

2.1性行為觀察

從圖1可以看出，小鼠捕捉潛伏期在36 h SD處理后較對(duì)照組延長(zhǎng)，與對(duì)照組存在極顯著差異（P<001），處理組捕捉潛伏期極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。

從圖2可以看出，36 h SD處理后，處理組捕捉次數(shù)極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。

2.2精子活率

從圖3可以看出，SD 處理36 h后小鼠的精子活率比對(duì)照組（0 h）低，且存在顯著性差異（P<0.05）；對(duì)照組A級(jí)精子數(shù)明顯高于處理組，且36 h處理組有4只小鼠沒(méi)有觀察到A級(jí)精子。

2.3精子畸變率

從圖4可以看出，小鼠精子畸變率在 SD 36 h 處理后較對(duì)照組有明顯升高，且處理組與對(duì)照組存在極顯著差異（P<0.01）。36 h SD組多見(jiàn)明顯畸變精子，以尾折疊、不定形頭部為常見(jiàn)。

3結(jié)論與討論

雄性動(dòng)物的捕捉潛伏期（Capture incubation period，CIP）和捕捉次數(shù)（Capture times，CT）的改變作為一種生殖行為異常的特征，已被許多學(xué)者推薦或用于評(píng)價(jià)雄性生殖行為異常[4，10]。CIP和CT的改變是評(píng)價(jià)性功能的最優(yōu)指標(biāo)。該研究表明，睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠CIP和CT有顯著影響，與對(duì)照組相比睡眠剝奪36 h可使雄性小鼠潛伏期極顯著延長(zhǎng)（P<0.01），捕捉次數(shù)極顯著減少（P<0.01）。這表明中長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪（36 h SD）可使小鼠性行為能力明顯降低。

研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪可使小鼠精子活率顯著下降[5]。該研究表明中長(zhǎng)時(shí)間（36 h）睡眠剝奪也可使精子活率有明顯的下降趨勢(shì)（P<0.05）。睡眠剝奪能使精子活率下降，可能與氧自由基生成過(guò)多產(chǎn)生氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。該研究還發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪36 h可使小鼠精子畸變率極顯著升高（P<0.01），其精子畸變多表現(xiàn)為無(wú)鉤、胖頭、無(wú)定形、尾折疊。尤其尾折疊和無(wú)定形現(xiàn)象已經(jīng)比較明顯，說(shuō)明36 h的睡眠剝奪已經(jīng)對(duì)雄性動(dòng)物精子質(zhì)量及子代健康造成嚴(yán)重威脅。

參考文獻(xiàn)

[1] RECHTSCHAFFEN A，BERGMANN B M.Sleep deprivation and host defense [J].American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2001（2）：602-603.

[2] HEALY D，WATERHOUSE J M.？Reactive rhythms and endogenous clocks [J].Psychological Medicine，1991（3）：557-564.

[3] HASLER G，BUYSSE D，KLAGHOFER R.The association between short sleep duration and obesity in young adults：A 13-year prospective study[J].Sleep，2004，27（4）：661-666.

[4] 周東升，周錦，鄭池樂(lè)，等.睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠體重及性行為的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，467（12）：189-191.

[5] 周東升，周錦，鄭池樂(lè)，等.睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015，469（1）：15-19.

[6] 蔣超，周冉，夏聰聰，等.72h睡眠剝奪對(duì)雄性小鼠的生殖毒性效應(yīng)及機(jī)制[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013（7）：1325-1326.

[7] ZHANG J Y，CHEN Z T，TAISHI P，et al.Sleep deprivation increases rat hypothalamic growth hormone-releasing hormone mRNA [J].American Journal of Physiology-Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，1998，275（6）：1755-1761.

[8] 陳亞.丙烯晴對(duì)雄性小鼠生殖毒性研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2010.

[9] 秦椿華，丁健中.化學(xué)物致突變致癌檢測(cè)技術(shù)[M].烏魯木齊：新疆衛(wèi)生科技出版社，1996：89.

[10] 王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：238-239.

[11] 吳晶晶，樊慧杰，王貴吉.Smad7和TGF-β_1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（13）：23-24.