沈嘉　郭東鋒　姜超強(qiáng)　楊波　姚忠達(dá)　祖朝龍

摘 要 以2個(gè)烤煙品種（紅花大金元和K326）為供試作物，研究增強(qiáng)UV-B輻射、干旱及交叉脅迫對(duì)煙草活性氧水平、膜質(zhì)過氧化、膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性等逆境生理指標(biāo)的影響，旨在揭示植物對(duì)紫外和干旱交叉脅迫的適應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明：UV-B輻射和干旱脅迫可導(dǎo)致煙草H2O2含量上升，膜穩(wěn)定性相應(yīng)下降。當(dāng)2種脅迫同時(shí)發(fā)生時(shí)，煙草氧化損傷程度低于單因子脅迫或處于2種單因子脅迫之間。產(chǎn)生這種交叉適應(yīng)性的原因可能是UV-B輻射誘導(dǎo)的抗氧化酶活性增強(qiáng)和干旱誘導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物含量增加產(chǎn)生疊加作用，增強(qiáng)了植株的抗氧化能力，從而緩解了彼此對(duì)植物體造成的氧化損傷。紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力高于K326。

關(guān)鍵詞 UV-B輻射；干旱；煙草；逆境生理

中圖分類號(hào) TS411 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

植物在野外生長(zhǎng)時(shí)不可避免的受到各種環(huán)境脅迫影響，如干旱、極端溫度、強(qiáng)光、重金屬、輻射、空氣污染等。當(dāng)多種脅迫同時(shí)發(fā)生時(shí)，一種脅迫因子可能會(huì)改變植物對(duì)其他脅迫因子的敏感性，稱為交叉適應(yīng)性（Cross Adaptation）[1]。逆境交叉適應(yīng)性存在某些共同的生理基礎(chǔ)，植物可以通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、活性氧清除系統(tǒng)等的變化，增強(qiáng)植物的逆境交叉耐受性或適應(yīng)性。但不同植物對(duì)于逆境交叉脅迫的耐受性或適應(yīng)性發(fā)展過程中，各種生理生化指標(biāo)的變化不盡相同[2]。

隨著全球變暖的加速和人類活動(dòng)對(duì)臭氧層的破壞，干旱和UV-B輻射增強(qiáng)已成為植物生長(zhǎng)最常遭遇的環(huán)境脅迫，對(duì)作物生產(chǎn)的影響也越發(fā)明顯[3]。由于干旱脅迫常常與UV-B脅迫同時(shí)發(fā)生，人們開始關(guān)注增強(qiáng)UV-B輻射和干旱脅迫對(duì)植物的復(fù)合影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱是與UV-B輻射復(fù)合作用最明顯的環(huán)境因子，如Kilian等[4]發(fā)現(xiàn)擬南芥在UV-B輻射和干旱脅迫下的基因表達(dá)具有高度重疊性。Teramura[5]、Tian[6]等分別發(fā)現(xiàn)UV-B輻射和干旱脅迫對(duì)大豆和小麥光合性能和生長(zhǎng)的抑制有疊加作用；Sangtarash等[7]發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)UV-B輻射環(huán)境使干旱脅迫對(duì)Stellaria longipes葉面積和干物質(zhì)積累的抑制作用增強(qiáng)。相反，Balakumar等[8]報(bào)道UV-B輻射和干旱脅迫同時(shí)發(fā)生時(shí)豇豆的生長(zhǎng)速率高于單獨(dú)脅迫；Schmidt等[9]發(fā)現(xiàn)UV-B-干旱交叉脅迫對(duì)擬南芥葉片含水量的維持有改善效果；Alexieva等[10]研究表明豌豆和小麥在UV-B-干旱交叉脅迫下比UV-B輻射單獨(dú)脅迫時(shí)獲得更多的生長(zhǎng)量，He等[11]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理后小麥對(duì)UV-B脅迫抗性增強(qiáng)，反之相同。這些不盡相同的試驗(yàn)結(jié)果表明干旱脅迫和UV-B脅迫對(duì)植物的影響確實(shí)存在交互作用。

有關(guān)植物逆境交叉脅迫引起耐受性或適應(yīng)性的研究已有大量報(bào)道，但主要集中在水稻、玉米等作物、部分蔬菜及果樹方面[2]，且關(guān)于其產(chǎn)生機(jī)制的報(bào)道目前并不多見。本試驗(yàn)以對(duì)環(huán)境敏感性不同的2個(gè)烤煙品種（紅花大金元和K326）為模式作物，研究增強(qiáng)UV-B輻射、干旱及交叉脅迫下保護(hù)性酶、滲透調(diào)節(jié)物及相關(guān)逆境生理指標(biāo)的變化，目的在于從氧化脅迫及抗氧化反應(yīng)方面初步探討植物對(duì)UV-B輻射和干旱產(chǎn)生交叉適應(yīng)性的相關(guān)機(jī)制，為探索有效的抗逆栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心試驗(yàn)溫室開展。供試材料為煙草栽培品種紅花大金元和K326。煙草包衣種子播撒于裝有育苗基質(zhì)的泡沫漂盤中，漂浮法培養(yǎng)至成苗（約60 d）。蒸餾水洗凈根部基質(zhì)，移栽至裝有粗石英砂（粒徑2.3 mm）的塑料缽中（直徑9 cm，高10 cm，底部無孔），每缽1株。塑料缽中注入1/4濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，后轉(zhuǎn)為1/2濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)期間溫室內(nèi)平均晝/夜溫度為34 ℃/23 ℃，相對(duì)濕度65%～85%，自然光照，光周期約14 h/d。20 d后挑選長(zhǎng)勢(shì)一致植株開始增強(qiáng)UV-B輻射與模擬干旱處理。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)置 試驗(yàn)設(shè)置增強(qiáng)UV-B處理，PEG6000模擬干旱處理和增強(qiáng)UV-B-干旱復(fù)合處理。UV-B輻射處理方法為將UV-B燈管（南京華強(qiáng)生產(chǎn)，297 nm，30 W）平行懸掛于植株上方，用0.13 mm 醋酸纖維素膜包裹燈管過濾280 nm以下波長(zhǎng)UV-B線。調(diào)整燈管與煙株的距離，同時(shí)使用UV-B照度計(jì)（北京師范光電設(shè)備研究所生產(chǎn)）測(cè)量植株頂端輻射強(qiáng)度，使之達(dá)到試驗(yàn)要求。光照時(shí)間為每日10 ： 00～16 ： 00。模擬干旱處理方法為將營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的聚乙二醇6000（PEG6000）。具體處理方法如表1所示。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 7 d后收獲各處理植株完全展開葉，洗凈表面塵土后進(jìn)行生化分析。每處理收獲5株，單獨(dú)測(cè)定作為重復(fù)。煙草葉片游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法[12]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[12]。膜穩(wěn)定指數(shù)（MSI）測(cè)定參照Hichem等[13]的方法。過氧化氫（H2O2）含量測(cè)定參照Patterson等[14]的方法。過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性采用檢測(cè)試劑盒測(cè)定（南京建成生產(chǎn)）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Excel 2007進(jìn)行初步處理，SPSS13.0進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫

H2O2是最主要也是最穩(wěn)定的ROS，可以代表系統(tǒng)內(nèi)ROS的整體水平。圖1-A、B表明，無論在UV-B脅迫還是在干旱脅迫下，煙草葉片的H2O2濃度都比對(duì)照顯著升高，且UV-B脅迫升高幅度大于干旱脅迫。交叉脅迫對(duì)H2O2濃度的影響在2個(gè)品種中表現(xiàn)不同：在紅大品種中，交叉脅迫植株H2O2濃度維持與干旱脅迫一致水平；而在K326品種中與UV-B脅迫植株保持一致。

2.2 膜脂過氧化反應(yīng)

2種環(huán)境脅迫都能造成紅大品種（圖1-C）葉片中MDA含量顯著升高，其中UV-B脅迫升高108.39%，干旱脅迫升高67.30%，而在交叉脅迫中葉片MDA含量與對(duì)照無顯著差異。說明單因子脅迫可導(dǎo)致紅大品種發(fā)生不同程度的膜脂過氧化反應(yīng)（UV-B脅迫>干旱脅迫），而交叉脅迫有助于提高紅大對(duì)膜脂過氧化的抗性。K326品種（圖1-D）UV-B脅迫植株MDA含量提高148.52%，而干旱脅迫植株與對(duì)照無顯著差異，說明K326對(duì)干旱脅迫有一定耐受能力。交叉脅迫對(duì)K326品種氧化損傷的修復(fù)作用不明顯，MDA含量與UV-B脅迫無差異。

為了研究煙草在脅迫環(huán)境下ROS水平對(duì)膜脂過氧化反應(yīng)的影響，本研究建立了MDA含量和H2O2的相關(guān)性方程（圖2-A）。結(jié)果表明，2個(gè)品種在環(huán)境脅迫下葉片膜脂過氧化產(chǎn)物和H2O2濃度呈顯著線性正相關(guān)（R2達(dá)到0.9以上），但K326品種的斜率小于紅大，表明K326對(duì)氧化脅迫的耐受性大于紅大。

2.3 膜穩(wěn)定性

膜穩(wěn)定性指數(shù)（MSI）分析結(jié)果（圖1-E、F）表明：在UV-B脅迫和干旱脅迫下，2個(gè)品種煙草的膜系統(tǒng)穩(wěn)定性顯著降低，其中UV-B脅迫對(duì)膜的損傷效果更大。2品種之間比較，在UV-B脅迫下K326品種膜穩(wěn)定性低于紅大，在干旱脅迫下相反，說明K326品種對(duì)UV-B脅迫更敏感，而紅大品種對(duì)干旱脅迫更敏感。當(dāng)交叉脅迫發(fā)生時(shí)，紅大品種膜穩(wěn)定性雖然比對(duì)照降低，但降低幅度小于單因子脅迫，而在K326品種中這種復(fù)合影響不明顯。

相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖2-B），煙草葉片膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與H2O2呈顯著負(fù)相關(guān)，說明可以通過活性氧水平評(píng)價(jià)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。從線性方程來看，紅大的膜系統(tǒng)更容易在H2O2過量積累時(shí)受到氧化損傷。

2.4 游離脯氨酸

圖1-G和圖1-F表明，煙草在干旱脅迫下葉片內(nèi)游離脯氨酸含量顯著增加，而UV-B脅迫對(duì)游離脯氨酸含量無顯著影響。在交叉脅迫中，葉片脯氨酸含量保持與干旱脅迫相同水平，說明脯氨酸在葉片中的積累主要取決于干旱脅迫環(huán)境。

2.5 保護(hù)性酶系統(tǒng)

增強(qiáng)UV-B輻射處理中，2個(gè)煙草品種CAT和SOD活性顯著提升；POD活性在紅大品種中比對(duì)照略有上升但差異不顯著，而在K326品種中幾乎不變。當(dāng)遭受干旱脅迫時(shí)，紅大品種SOD和CAT活性受到明顯抑制，而POD活性比對(duì)照略有提升；K326品種所有被測(cè)定的酶活性下降（圖3）。在交叉脅迫處理中，所有酶活性變化幾乎與增強(qiáng)UV-B輻射處理保持一致。這一結(jié)果表明當(dāng)環(huán)境中UV-B輻射增強(qiáng)和干旱脅迫同時(shí)發(fā)生時(shí)，UV-B輻射對(duì)保護(hù)性酶活性的影響大于干旱脅迫。

3 討論與結(jié)論

活性氧（ROS）是植物生理代謝過程中的正常產(chǎn)物，普通環(huán)境下在植物體內(nèi)維持較低水平。當(dāng)植物遭受生物或非生物脅迫環(huán)境時(shí)，組織內(nèi)ROS產(chǎn)生-清除系統(tǒng)平衡被打破而過度積累，引發(fā)膜脂過氧化，最終致使植物組織氧化損傷或細(xì)胞程序性死亡[15]。丙二醛含量和膜穩(wěn)定性指數(shù)常常被人們用來衡量植物的氧化損傷程度[13]。為了研究ROS水平與氧化損傷程度之間的關(guān)系，筆者建立了ROS代表物質(zhì)H2O2含量與MDA含量及MSI的相關(guān)方程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脅迫環(huán)境下膜脂過氧化程度與ROS水平呈顯著正相關(guān)，而膜的穩(wěn)定性與ROS水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

在本研究中，當(dāng)2種脅迫單獨(dú)發(fā)生時(shí)，煙草表現(xiàn)出一定程度的氧化損傷特征，如H2O2含量顯著上升（圖1-A、B），MDA含量上升，膜穩(wěn)定性下降。當(dāng)2種脅迫同時(shí)發(fā)生時(shí)，煙草氧化損傷程度并非2種單獨(dú)脅迫的加和，而是低于單因子脅迫或處于2種單因子脅迫之間。因此可以推斷增強(qiáng)UV-B輻射和干旱能夠緩解彼此對(duì)植物造成的氧化損傷，即誘導(dǎo)植物產(chǎn)生交叉適應(yīng)性。這種現(xiàn)象2個(gè)品種中表現(xiàn)不一致：紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力強(qiáng)于K326。除了煙草，植物對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射和干旱脅迫的交叉適應(yīng)性在豇豆[8]、擬南芥[9]、小麥[10]和胡枝子[3]等物種中同樣存在。

植物抗性與抗氧化能力相關(guān)聯(lián)，酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的抗氧化水平在一定程度上決定植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力[16]。SOD、CAT和POD是酶保護(hù)系統(tǒng)的重要成員，研究結(jié)果表明：SOD處于抵御活性氧傷害的第一道防線，主要清除對(duì)植物毒性較大的O2·- ，將其轉(zhuǎn)化成為毒性較小的H2O2，CAT和POD進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化為無毒的H2O和O2，防御脂膜過氧化，維持系統(tǒng)內(nèi)自由基平衡[17]。本試驗(yàn)中紅大品種無論在正常環(huán)境還是在脅迫環(huán)境中，3種酶活性均高于K326，因而具有更高的抗氧化能力和抗逆性。與此相對(duì)應(yīng)的是在相同脅迫下紅大氧化損傷水平低于K326（圖1）。SOD和CAT活性在煙草遭受UV-B脅迫時(shí)上升，在干旱脅迫時(shí)下降。交叉脅迫中，3種酶活性幾乎都維持與UV-B單因子脅迫相同水平。說明UV-B是觸發(fā)煙草抗氧化酶活性增強(qiáng)的主要因素。脯氨酸是植物最主要的滲透調(diào)節(jié)物，還可作為自由基清除劑、膜的穩(wěn)定劑和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶的保護(hù)劑，從而對(duì)各種逆境脅迫起保護(hù)作用[18]。本研究中葉片脯氨酸含量在煙草遭受干旱脅迫和交叉脅迫時(shí)顯著升高，而在UV-B單因子脅迫時(shí)幾乎不受影響。表明干旱是造成脯氨酸含量上升的主要誘因。這一結(jié)果與許多研究保持一致，脯氨酸含量的升高也被認(rèn)為是典型的滲透脅迫反應(yīng)[19-21]。郝敬紅等[22]認(rèn)為這是由于干旱脅迫初期氮素同化被加快，而持續(xù)脅迫又會(huì)降低蛋白合成酶的活性，提高蛋白水解酶的活性而造成。

綜上所述，煙草在UV-B-干旱交叉脅迫時(shí)所受的氧化損傷低于單獨(dú)脅迫。產(chǎn)生這中交叉適應(yīng)性的原因可能是UV-B輻射誘導(dǎo)的抗氧化酶活性增強(qiáng)和干旱誘導(dǎo)的滲透調(diào)節(jié)物含量增加產(chǎn)生疊加作用，緩解了彼此對(duì)植物體造成的氧化損傷。然而，這種交叉適應(yīng)性在不同品種中表現(xiàn)不一致，從氧化損傷水平來看，紅大品種獲得交叉適應(yīng)性的能力高于K326。

參考文獻(xiàn)

[1] Bowler C， Fluhr R L. The role of calcium and activated oxygen as signals for controlling cross-adaptation[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5： 241-246.

[2] 耿興敏. 植物逆境交叉脅迫適應(yīng)性研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2014（4）： 14-18.

[3] 郝文芳， 趙 潔， 蔡彩虹， 等. 3種胡枝子抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)干旱和增強(qiáng)UV-B輻射的動(dòng)態(tài)響應(yīng)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013（8）： 2 349-2 358

[4] Kilian J， Whitehead D， Horak J， et al. The AtGenExpress global stress expression data set： protocols， evaluation and model data analysis of UV-B light， drought and cold stress responses[J]. Plant Journal， 2007， 50： 347-363.

[5] Teramura A H， Foresth I N， Lydon J. Effects of UV-B Radiation on the Plants during Mild Water Stress： The Insensitivity of Soybean Internal Water Relations to UV-B Radiation[J]. Physiol Plant， 1984， 62： 384-389.

[6] Tian X R， Lei Y B. Physiological responses of wheat seedlings to drought and UV-B radiation. Effect of exogenous sodium nitroprusside application[J]. Russian Journal of Plant Physiology， 2007， 54： 676-682.

[7] Sangtarash M H， Qaderi M M， Chinnappa C C， et al. Differential responses of two Stellaria longipes ecotypes to ultraviolet-B radiation and drought stress[J]. Flora-Morphology， Distribution， Functional Ecology of Plants， 2009， 204： 593-603.

[8] Balakumar T， Hani B V V， Paliwal K. On the Interaction of UV-B radiation（280-315 nm）with water stress in crop plants[J]. Physiol Plant， 1993， 87： 217-222.

[9] Schmidt A M， Ormrod D P， Livingston， et al. The interaction of ultraviolet-B radiation and water deficit in two Arabidopsis thaliana genotypes[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 571-575.

[10] Alexieva V， Sergiev I， Mapelli S， et al. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in Pea and Wheat[J]. Plant， Cell Environ， 2001， 24： 1 337-1 344.

[11] He L X. Jia Z L， Gao R， et al. Genotype dependent responses of wheat（Triticum aestivum L.）seedlings to drought， UV-B radiation and their combined stresses[J]. African Journal of Biotechnology， 2011， 10： 4 046-4 056.

[12] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 48-69.

[13] Hichema H， Mounirb D， Naceurc E A. Differential responses of two maize（Zea mays L.）varieties to salt stress： Changes on polyphenols composition of foliage and oxidative damages[J]. Industrial Crops and Products， 2009， 30： 144-151

[14] Patterson B D， Mackae E A， Ferguson I B. Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using titanium（IV）[J]. Aanalytical Biochemistry， 1984， 139： 487-492.

[15] Karuppanapandian T， Moon J C， Kim C， et al. Reactive oxygen species in plants： their generation， signal transduction， and scavenging mechanisms[J]. Australian Journal of Crop Science， 2011， 5（6）： 709-725.

[16] O'Brien J A， Daudi A， Butt V S， et al. Reactive oxygen species andtheir role in plant defence and cell wall metabolism[J]. Planta， 2012， 236（3）： 765-779.

[17] Chen Q， Zhang M， Shen S. Effect of salt on malondialdehyde and antioxidant enzymes in seedling roots of Jerusalem artichoke（Helianthus tuberosus L.）[J]. Acta Physiol Plant， 2010， 33： 273-278.

[18] 吳 娟， 施國(guó)新， 夏海威， 等. 外源鈣對(duì)汞脅迫下菹草（Potamogeton crispus L.）葉片抗氧化系統(tǒng)及脯氨酸代謝的調(diào)節(jié)效應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2014（2）： 380-387.

[19] 李 渡， 賈秀峰， 白慶武， 等. 干旱脅迫對(duì)苜蓿脯氨酸積累的影響[J]. 植物研究， 2003， 23（2）： 189-191.

[20] 李慥哲. 10種苜蓿品種幼苗抗旱性的研究[J]. 中國(guó)草地， 1991（3）： 1-3.

[21] 馬宗仁， 陳寶書. 甘肅地方苜蓿品種脯氨酸積累能力與抗旱性的關(guān)系研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1992（2）： 131-137.

[22]郝敬虹， 易 旸， 尚慶茂， 等. 水楊酸處理對(duì)干旱脅迫下黃瓜幼苗氮素同化及其關(guān)鍵酶活性的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2012（1）： 81-90.