吳麗民　卞文印　胡芳輝　連永樂　聶雅婷　王宗華　魯國東

摘 要 根據(jù)之前的基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌侵染水稻的過程中，許多基因被誘導(dǎo)表達(dá)。MGG14093為其中一個推測為編碼分泌蛋白的未知功能基因，在病菌侵染過程中該基因表達(dá)量上調(diào)2.906。利用生物信息學(xué)在線軟件對該基因編碼蛋白的特性進(jìn)行初步分析，并通過RT-PCR擴(kuò)增進(jìn)一步分析該基因在稻瘟病菌侵染水稻過程中的表達(dá)動態(tài)，利用基因敲除和過量表達(dá)技術(shù)對該基因的功能進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：該基因編碼蛋白為定位于胞外的分泌蛋白，沒有已知的蛋白結(jié)構(gòu)域，但可能存在幾處氨基酸活性位點。MGG14093基因敲除和過量表達(dá)后，對稻瘟病菌的營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢及附著胞分化沒有顯著的影響，但該基因過量表達(dá)后導(dǎo)致病菌的致病力下降，表明該基因可能參與病菌的致病過程。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示MGG14093基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌；MGG14093基因；致病性

中圖分類號 S435.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一[1]。在流行季節(jié)，稻瘟病可對全世界大約85個水稻生產(chǎn)國家，造成70%～80%的糧食生產(chǎn)損失[2]。據(jù)報道，每年因稻瘟病造成損失的糧食足夠養(yǎng)活60億的人口[3]。在中國，2001年和2005年稻瘟病的流行導(dǎo)致了570萬hm2的糧食絕收[4]。稻瘟病菌是一種致病的子囊真菌，是真菌病害分子機(jī)制研究的模式生物。對稻瘟病菌基因功能的研究，有助于揭示該菌致病的分子機(jī)理，也為稻瘟病防治策略的開發(fā)提供新的思路，因此，本研究具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。

稻瘟病菌的侵染是通過其特殊的結(jié)構(gòu)-附著孢形成的侵入栓侵入到寄主組織內(nèi)部。近年來的研究報道表明，附著孢介導(dǎo)的侵入過程受到幾個高度保守的信號網(wǎng)絡(luò)的控制，如G蛋白偶聯(lián)受體GPCRS、自噬、促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）、環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）及Ca2+調(diào)信號等，這些信號系統(tǒng)均受到基因的調(diào)控[5-6]。相關(guān)基因的缺失可影響稻瘟病菌的生長速度、交配和分生孢子的產(chǎn)生等。此外，稻瘟病菌的侵染還受到其它許多基因的調(diào)控，如MAGB、ACR、MgWC-1、CON7等[1]。在對病原菌與寄主互作的研究過程中，效應(yīng)子的研究也成為了熱點。目前陸續(xù)報道的細(xì)菌效應(yīng)子有PthA、PthXo1、PthXo6、AvrPto、Avrxa23、AvrBs3等[7-8]；真菌效應(yīng)子的報道也有很多，如稻瘟病菌的效應(yīng)蛋白Pwl1、Pw12、ACE1、Avr1CO-39、AvrPi-ta、AvrPiz-t、Avr-Pi、AvrPii、Avr-Pik等[9-10]，這些研究為進(jìn)一步揭示病原菌的致病機(jī)理奠定了良好基礎(chǔ)。通過稻瘟病菌全基因組基因芯片的分析，發(fā)現(xiàn)了許多在病菌侵染過程中差異表達(dá)的基因，本研究著重研究上調(diào)表達(dá)的MGG14093（log值為2.906）基因，并進(jìn)行缺失和過量表達(dá)分析，初步明確該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟病菌（M. oryzae）菌株Guy11、△Ku80及水稻品種CO39保存于作者所在實驗室。

1.2 方法

1.2.1 序列的獲得與分析 在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/

magnaporthe_grisea/MultiHome.html）中，查找獲得MGG14093的氨基酸序列及對應(yīng)的核苷酸序列；使用BLASTP搜索工具，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其同源蛋白序列；利用SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）工具，對MGG14093蛋白序列進(jìn)行信號肽分析；利用ProtComp v. 9.0（http：//www.softberry.com/）在線工具進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析；利用生物在線工具ExPASy（http：//prosite.expasy.org/）對MGG_14093蛋白質(zhì)可能存在的活性位點進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2 基因各階段表達(dá)的驗證 提取稻瘟病菌野生型菌株Guy11的菌絲及其侵染水稻后48、72、96 h的水稻RNA；以14093 OF和14093 OR為引物，采用半定量RT-PCR方法，擴(kuò)增MGG14093基因的ORF（閱讀框）序列；在稻瘟病菌野生型菌株Guy11在菌絲生長過程中和侵染水稻親和品種CO39 48、72、96 h后，檢測MGG14093基因的表達(dá)量，并分析該基因在不同時段的表達(dá)動態(tài)。PCR擴(kuò)增[11]的熱循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s ，循環(huán)31次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 基因敲除突變體的獲得 以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，采用引物14093AF和14093AR擴(kuò)增稻瘟病菌MGG14093開放閱讀框（ORF）上游1 005 bp的A片段，并克隆到pCX62載體14093-A的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點之間；同理，采用引物14093BF和14093BR，擴(kuò)增該基因開放閱讀框（ORF）下游878 bp的B片段，并克隆到pCX62載體BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點之間，最后獲得基因敲除載體pCX62-14093-AB；以稀釋后的基因敲除載體pCX62-14093-AB為模板，采用引物14093AF和14093BR擴(kuò)增A-hph-B片段所得的適量A-hph-B片段PCR產(chǎn)物，在PEG介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化到新鮮制備好的△ku80的原生質(zhì)體，通過同源重組的方法進(jìn)行基因敲除[11]。利用PCR方法篩選基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化子，用1593OF和15293OR擴(kuò)增突變體野生型菌株的239 bp的ORF，用A片段上游71 bp擴(kuò)增UAH的前引物14093UA和潮霉素內(nèi)部H853的后引物擴(kuò)增1 450 bp的UAH片段。上述PCR擴(kuò)增的體系及反應(yīng)條件參照1.2.2，退火溫度見表1。

1.2.4 基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建和突變體的獲得 過量表達(dá)載體的構(gòu)建：利用pET11上的xhoⅠ和speⅠ的2個酶切位點，設(shè)計引物14093OEF和14093OER擴(kuò)增MGG_14093編碼閱讀框序列，載體和PCR產(chǎn)物分別酶切，連接到pET11載體上；在PEG介導(dǎo)下，將構(gòu)建好的14093PTE11過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到新制備好的△ku80原生質(zhì)體上，用潮霉素篩選過表達(dá)轉(zhuǎn)化子，用RT-PCR驗證過量表達(dá)突變體。

1.2.5 MGG14093突變體表型分析 （1）生長速度測定：取濾紙片保存的菌株在淀粉酵母瓊脂培養(yǎng)基上活化，生長3～4 d后，在菌落的外緣用直徑0.5 cm的打孔器打孔，將圓形的菌絲塊倒放在新的淀粉酵母瓊脂培養(yǎng)基平板上，在28 ℃溫度下倒置培養(yǎng)；在生長的第3、5、7、9天分別測量菌落的直徑，到第10天時，進(jìn)行拍照。

（2）產(chǎn)孢量分析：用Wu等[11]的方法收集基因敲除突變體、異位整合突變體、過量表達(dá)突變體及野生型菌株突變體的分生孢子并計數(shù)。用米糠培養(yǎng)基產(chǎn)孢，孢子以1～5×104個/mL濃度20 μL/滴，滴在疏水膜上，28 ℃保濕暗培養(yǎng)，每2 h觀察孢子的萌發(fā)、附著孢的產(chǎn)生并計數(shù)。

（3）致病性鑒定：水稻親和品種（品種CO39）培養(yǎng)15 d左右，將稻瘟病菌各菌株濃度為1×105～2×105個/mL的孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，黑暗無光照條件下，保濕24 h后，28 ℃連續(xù)保濕、光照6 d， 在第7天調(diào)查病情[11]，將感病葉片掃描并存檔。

以上每個實驗均做3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的ANOVA差異著性分析采用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 MGG14093.6的生物信息學(xué)分析

稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫中，MGG14093基因的大小為572 nt，編碼1個168 aa未知功能的蛋白（predicted protein）。利用Blastp尋找同源相似蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠匹配到的已知蛋白序列中，氨基酸的同源性很低；SignalP分析結(jié)果顯示，該蛋白中信號肽預(yù)測值是0.951；采用ProtComp v. 9.0軟件定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于胞外；采用ProtParam軟件分析該蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量和理論等電點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白（表2）。

在線工具ExPASy預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGG14093蛋白質(zhì)可能存在幾處氨基酸活性位點，如環(huán)腺苷酸磷酸化位點、乙酰化位點、酪氨酸激酶2磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點等。這些可能存在的磷酸化或者乙?；稽c對于蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮可能起著重要的作用。

2.2 MGG14093基因的表達(dá)動態(tài)

半定量RT-PCR結(jié)果見圖1，與參照基因Actin相比，該基因在病菌侵染水稻的48 h后表達(dá)量最大。該結(jié)果與筆者之前基因芯片的結(jié)果一致（侵染過程中上調(diào)表達(dá)，log值為2.906）。因此，MGG14093基因可能參與稻瘟病菌的致病過程。 2.3 MGG14093基因敲除突變體與過量表達(dá)突變體的獲得

MGG14093基因敲除轉(zhuǎn)化子PCR驗證結(jié)果見圖2，△ku80對照（泳道4）可擴(kuò)增到MGG_14093基因的ORF片段，因不含潮霉素基因，未擴(kuò)增到A片段上游71 bp到潮霉素內(nèi)部引物間的的UAH片段。異位整合突變體（ectopic）由于潮霉素基因片段的插入位點不在ORF內(nèi)，所以也未擴(kuò)增到UAH片段（泳道2），但卻能在添加潮霉素的培養(yǎng)基上生長。MGG14093基因的2個敲除突變體，分別命名為△ko21和△ko38，則未擴(kuò)增到MGG14093的ORF，卻可擴(kuò)增UAH片段（泳道1和3），因為該基因的ORF被潮霉素基因所替代。

MGG14093基因ORF插入到pET11載體上，由RP27強(qiáng)啟動子驅(qū)動下過量表達(dá)。隨機(jī)挑選過表達(dá)轉(zhuǎn)化子，用RT-PCR方法驗證基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)轉(zhuǎn)化子中MGG14093均有過量表達(dá)，其中Oe2和Oe3是表達(dá)量較高的過量表達(dá)突變體。

2.4 MGG14093基因突變體生長和產(chǎn)孢情況

MGG14093基因敲除突變體和過量表達(dá)突變體的產(chǎn)孢量統(tǒng)計、菌落直徑的測量結(jié)果表明，p值都大于0.05，目的基因的缺失突變體和過量表達(dá)突變體在生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及附著孢形成上均與對照無顯著差異（圖3和表3）。

2.5 MGG14093突變體的致病性分析

MGG14093基因敲除突變體和過量表達(dá)突變體的致病性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在清水對照不致病的基礎(chǔ)上，與陽性對照△kou80相比，基因缺失突變體（△ko21和△ko38）對水稻的致病性沒有明顯改變，但基因過量表達(dá)突變體的致病力降低，表現(xiàn)為感病病斑數(shù)明顯減少（圖4）。

3 討論與結(jié)論

查尋稻瘟病菌基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MGG14093基因分子量低，并且在該菌的各個生長發(fā)育階段的表達(dá)量均很低。本試驗通過RT-PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Actin相比，該基因的總體表達(dá)量均較低，但在病菌侵染水稻后48 h時表達(dá)量升高較為明顯，說明該基因在稻瘟病菌的侵染初期可能有一定的功能。在線工具ExPASy預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGG14093蛋白可能存在幾處氨基酸活性位點（如環(huán)腺苷酸磷酸化位點等），而這些可能存在的磷酸化或者乙?；稽c或許對于蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮至關(guān)重要。SignalP和ProtComp分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGG14093為定位于胞外的分泌蛋白。而病原真菌分泌蛋白通常起著細(xì)胞壁降解酶或者效應(yīng)子的功能[12]。植物對病原菌的免疫主要方式有2種，一是通過引發(fā)病原相關(guān)的分子模式（PAMP）PTI進(jìn)行免疫，二是由病原的個別效應(yīng)子誘發(fā)植物的免疫反應(yīng)（ETI）[13-14]。效應(yīng)子通常能夠增加或者降低酶的活性、細(xì)胞表達(dá)或細(xì)胞信號。病原真菌的效應(yīng)子作用于寄主細(xì)胞或外質(zhì)體，可能與糖基化有關(guān)，能夠抑制植物的免疫反應(yīng)[15]。如效應(yīng)子Slp1通過Alg3介導(dǎo)的α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ調(diào)節(jié)稻瘟病菌Slp1的N端糖基化，隔離幾丁質(zhì)低聚糖與水稻幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白CEBiP受體之間的結(jié)合而避免被水稻識別[15-16]，從而阻止了由幾丁質(zhì)誘發(fā)的寄主免疫[17]。大部分的效應(yīng)子通常是分子量小的分泌蛋白，通常缺乏與已知蛋白的同源性[18-19]，同源比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGG_14093與已知蛋白都沒有同源性，說明它可能不是一種胞外酶，而有可能是稻瘟病菌的一種效應(yīng)蛋白，在稻瘟病菌中的定殖和擴(kuò)展過程中有著重要的功能。

MGG14093基因的敲除和過量表達(dá)突變體，在生長速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和附著孢的形成率上與△ku80對照無明顯區(qū)別，說明該基因可能不參與稻瘟病菌的生長、產(chǎn)孢和附著孢分化。而且MGG14093基因敲除突變體在致病性方面也無顯著的改變，說明該基因可能存在功能冗余。Hiromasa等[12]在研究效應(yīng)子的過程中，對稻瘟病菌侵染水稻早期都有表達(dá)的78個分泌蛋白基因進(jìn)行了敲除，大部分的突變體對生長、致病性及產(chǎn)孢量都沒有影響，mc69突變體對生長速度、分生孢子的產(chǎn)生及附著孢的成熟都沒有影響，只是在附著孢成熟后不能成功的形成侵染菌絲；稻瘟病菌效應(yīng)子基因敲除后致病性無變化也是一種常見的現(xiàn)象[10]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGG14093基因過量表達(dá)后導(dǎo)致了病菌的致病性減弱，說明該基因的編碼蛋白可能是具有激發(fā)子功能的效應(yīng)蛋白，該功能還需通過其它實驗進(jìn)一步驗證。

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