徐?！⒕骸≈車?guó)英　李冬琴　羅娜　黃馨

中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004

摘 要 利用PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基從不同林齡的降香黃檀-檀香根際土壤中分離篩選高效解磷菌，為進(jìn)一步研制專用生物復(fù)合肥提供依據(jù)。通過(guò)溶磷圈法篩選溶磷較強(qiáng)（D/d值大于1.5）的菌株19株，采用鉬銻鈧比色法測(cè)定其解磷能力。結(jié)果顯示：菌株無(wú)機(jī)磷溶量在9.23～223.27 μg/mL之間，3株菌無(wú)機(jī)磷溶量在170 μg/mL以上；菌株有機(jī)磷溶量在0.43～25.05 μg/mL之間，有機(jī)磷溶量在15 μg/mL以上有4株。采用Salkowski 比色法測(cè)定菌株分泌IAA能力，10株菌具有分泌能力，其中DosaP25分泌IAA量達(dá)32.14 μg/mL。綜上所述，菌株DosaP15、DosaP25具有較強(qiáng)的解磷、分泌IAA能力?；谛螒B(tài)學(xué)、生理生化特性及16 S rDNA序列比較分析，初步鑒定DosaP15屬于Bacillus pumilus、DosaP25屬于Bacillus subtilis。試驗(yàn)同時(shí)表明，菌株溶磷量、分泌IAA量與培養(yǎng)液pH值之間不存在顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 降香黃檀；檀香；根際解磷菌；解磷能力；IAA

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素且主要從土壤中獲取，而土壤中絕大部分磷以難溶狀態(tài)存在，不利于植物吸收，成為限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在著將植物難以吸收的難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化成有效態(tài)磷的微生物，稱其為解磷菌或溶磷菌[3]。甚至部分解磷菌還能分泌促生物質(zhì)，改善植物根際土壤環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4-5]。喬志偉等[6]從石灰性土壤作物根際分離溶磷細(xì)菌，其中W25對(duì)磷酸三鈣的溶解能力達(dá)385.5 mg/L，同時(shí)可分泌甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸。

降香黃檀（Dalbergia odorifera）為豆科蝶形花科半落葉喬木，國(guó)家II級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[7]；檀香（Sandalwood）為半寄生性常綠喬木，須與寄主共生才能存活[8]。兩者均為珍貴紅木用材樹(shù)種，心材堅(jiān)硬、耐濕耐腐，是制作名貴木制品的重要原料，具有重要的藥用價(jià)值[9-10]。然而降香黃檀、檀香生長(zhǎng)緩慢，通常數(shù)十年才能成材，人為盜伐嚴(yán)重，野生資源已瀕臨滅絕。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)降香黃檀、檀香的大規(guī)模推廣種植，以推動(dòng)貧困地區(qū)致富，同時(shí)對(duì)降香黃檀、檀香種質(zhì)資源起到有效的保護(hù)。其中以降香黃檀-檀香混交模式種植，效果較好。檀香抑制降香黃檀快速增高有利于其心材的形成，降香黃檀為檀香提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)檀香生長(zhǎng)[11-12]。但降香黃檀、檀香幼苗（幼林）長(zhǎng)勢(shì)差、生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題未得到有效解決，同時(shí)大量化肥的施用引起了環(huán)境污染、生產(chǎn)成本增加等問(wèn)題。本文旨在從降香黃檀、檀香根際土壤中篩選出高效解磷菌，研究其解磷、分泌IAA等特性，為專用生物復(fù)合肥研制提供理論基礎(chǔ)，以解決降香黃檀、檀香幼苗（幼林）長(zhǎng)勢(shì)差、生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題，到達(dá)減少化肥施用量、降低生產(chǎn)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 在海南省降香黃檀、檀香種植區(qū)（澄邁、定安、尖峰、東方、白沙等地），利用五點(diǎn)隨機(jī)采樣法，采集3、4、5、6、7、10年生的降香黃檀、檀香根際土壤（20～40 cm），裝入保鮮袋（無(wú)菌）中，冷凍保存帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基、King氏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等[13]。

1.2 方法

1.2.1 根際高效解磷細(xì)菌的分離 稱取樣品10 g（不同林齡的降香黃檀、檀香土樣），置入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩20 min，制成土壤懸液。采用10倍稀釋法配制濃度梯度為10-4、10-5、10-6的土壤懸液樣品，用于解磷細(xì)菌的分離。每個(gè)濃度梯度吸取100 uL涂布于PKO無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，恒溫28 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落，做好標(biāo)記后選用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化，4 ℃保存。

1.2.2 菌株解磷能力測(cè)定 定性測(cè)定：將分離純化后的培養(yǎng)物采用PKO無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基、恒溫28 ℃培養(yǎng)4 d，記錄D/d（溶磷圈直徑/菌落直徑）值，篩選D/d 值較大的菌株，用LB培養(yǎng)基斜面保存。

定量測(cè)定：在250 mL三角瓶中加入滅菌的100 mL PKO無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基或蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，取1 mL待測(cè)菌株菌懸液（108 cfu/mL）分別加入到250 mL三角瓶中，160 r/min，恒溫30 ℃培養(yǎng)7 d，測(cè)定培養(yǎng)介質(zhì)pH值；對(duì)照組用1 mL無(wú)菌水替換1 mL菌液，其余條件不變。將培養(yǎng)液4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液OD700 nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株的無(wú)機(jī)磷（有機(jī)磷）溶量[14]。

1.2.3 菌株分泌IAA能力測(cè)定 用分光光度計(jì)，采用Salkowski比色法[15]測(cè)定波長(zhǎng)530 nm的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出IAA分泌量，并各測(cè)定各菌液的環(huán)境pH值。

1.2.4 菌株鑒定 菌株形態(tài)觀察：記錄待鑒定菌株在蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的菌落特征，用顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

生理生化：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠編），進(jìn)行細(xì)菌生理生化試驗(yàn)。

16 S rRNA序列測(cè)定及分析：以提取的待測(cè)細(xì)菌菌株基因組DNA為模板，選用細(xì)菌16 S rRNA基因通用引物27F和1492R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30個(gè)，72 ℃ 10 min。將所得產(chǎn)物樣品送至上海博尚生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，利用EGA5.05軟件，使用Neighbor-Joining法進(jìn)行計(jì)算分析（Bootstraps=1 000），構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和多重比較（LSD法和Duncan檢驗(yàn)），并用Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際高效解磷細(xì)菌的分離、篩選

2.1.1 解磷細(xì)菌的分離純化 利用PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基，從不同林齡（3、4、5、6、7、10 a）的降香黃檀、檀香根際土壤，分離純化出可培養(yǎng)物187個(gè)。菌落呈近圓形或橢圓形、白色或黃色、半透明或不透明、大部分表面扁平、邊緣規(guī)則、生長(zhǎng)速度中等。

2.1.2 菌株解磷能力定性測(cè)定 利用溶磷圈法在PKO無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，測(cè)定各菌株溶解磷酸鈣能力，篩選出D/d值大于1.5的菌株共計(jì)19株（圖1）。其中9株菌株的D/d值在1.5～2.0之間，占測(cè)定菌株的47.36%；D/d值在2.0～2.5間的菌株有6株，占測(cè)定總數(shù)的31.58%；有4株的D/d值大于2.5，占測(cè)定總數(shù)的21.05%。溶解磷酸鈣能力較強(qiáng)菌株是DosaP25，D/d值達(dá)到4.1；其次是DosaP7，D/d值為3.23。

2.1.3 菌株解磷能力定量測(cè)定 各菌株溶解無(wú)機(jī)磷（磷酸鈣）的量在9.23～223.27 μg/mL之間（表1），其中3株菌的無(wú)機(jī)磷溶量在170 μg/mL以上，占供試菌株的15.79%。DosaP25溶解磷酸鈣的量高達(dá)223.27 μg/mL，其次是DosaP15和DosaP23，分別達(dá)196.47、174.32 μg/mL。無(wú)機(jī)磷溶量在20～100 μg/mL間的菌株有9株，占供試總數(shù)的47.37%；5株菌株的無(wú)機(jī)磷溶量在20 μg/mL以下，占供試總數(shù)的26.32%。除菌株DosaP2與DosaP10間無(wú)顯著差異外，其它菌株間均達(dá)到顯著差異（p<0.05）。DosaP25的溶解無(wú)機(jī)磷能力是DosaP5（9.23 μg/mL）的24.19倍，是對(duì)照組（4.55 μg/mL）的49.07倍。

同時(shí)測(cè)定各菌株對(duì)有機(jī)磷（卵磷脂）的溶解能力，供試菌株對(duì)卵磷脂的溶解量在0.43～25.05 μg/mL之間。有機(jī)磷溶量在10 μg/mL以下的菌株有13株，占供試總數(shù)的68.42%；5株菌株的有機(jī)磷溶量在10～20 μg/mL之間，占供試總數(shù)的26.32%；其中DosaP15溶解卵磷脂的能力最強(qiáng)，達(dá)到25.05 μg/mL，其次是DosaP25（19.22 μg/mL）。菌株DosaP3與DosaP9、DosaP4與DosaP16之間卵磷脂溶解量無(wú)顯著差異，其余菌株之間差異顯著（p<0.05）。DosaP15、DosaP25溶解有機(jī)磷的能力分別是DosaP5的58.26、44.70倍。

2.1.4 菌株解磷能力與終點(diǎn)pH值間關(guān)系 PKO無(wú)機(jī)磷、蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基的起始pH值均為7.2，各菌株P(guān)KO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值的測(cè)定結(jié)果顯示：終點(diǎn)pH值偏酸且隨著磷酸鈣溶解量的增加呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組的pH值在7.0附近略微變化（圖2）。DosaP15溶解磷酸鈣的量達(dá)223.27 μg/mL，對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值為5.62。17株菌株的培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值在6.0～7.0之間，占供試菌株的89.47%。菌株對(duì)磷酸鈣的溶解量與培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值之間不存在顯著的線性回歸關(guān)系，R2（相關(guān)系數(shù)）僅為0.850 6。

各菌株蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值的測(cè)定結(jié)果表明：與磷酸鈣的溶解量相比，隨著卵磷脂溶解量的增加，終點(diǎn)pH值的下降趨勢(shì)更加明顯（圖3）。6株菌株的培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值在5.23～6.0之間，占供試菌株總數(shù)的31.58%；菌株DosaP15溶解卵磷脂的量最大，其培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值（5.23）下降明顯；對(duì)照組的pH值無(wú)明顯變化。菌株溶解卵磷脂的量與終點(diǎn)pH值之間的相關(guān)系數(shù)為0.536，表明兩者之間無(wú)顯著線性回歸關(guān)系。

菌株的PKO無(wú)機(jī)磷、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值絕大部分集中在6.5左右，而對(duì)照組的起始pH值與終點(diǎn)pH值均在7.0左右。這些說(shuō)明解磷細(xì)菌分泌一些酸性物質(zhì)，使得H+數(shù)量增加導(dǎo)致pH值下降。DosaP5的終點(diǎn)pH值（6.13）低于DosaP14（6.15），但DosaP14的卵磷脂溶量（4.35 μg/mL）遠(yuǎn)高于DosaP5（0.43 μg/mL）。表明，解磷細(xì)菌溶解磷的能力不完全取決于培養(yǎng)介質(zhì)中H+的數(shù)量。

2.1.5 菌株分泌IAA能力測(cè)定 結(jié)果顯示（表2），10株菌株具有分泌IAA能力，占供試總數(shù)的52.63%；分泌IAA量在25 μg/mL以上的菌株有3株，即DosaP25（32.14 μg/mL）、DosaP23（28.7 μg/mL）、DosaP15（27.53 μg/mL）。各菌株之間分泌IAA能力差異顯著，其中DosaP25（32.14 μg/mL）分泌IAA量是DosaP5（4.56 μg/mL）的7.05倍。

King氏液體培養(yǎng)基的起始pH值為7.2，各菌株分泌IAA量與培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值之間的相關(guān)系數(shù)R2為0.944，表明菌株分泌IAA量與終點(diǎn)pH值之間無(wú)顯著的線性回歸關(guān)系（圖4）。隨著菌株分泌IAA量的增加，培養(yǎng)液終點(diǎn)pH值呈下降趨勢(shì)；無(wú)分泌IAA能力菌株培養(yǎng)介質(zhì)終點(diǎn)pH值偏中性或堿性，說(shuō)明菌株分泌IAA導(dǎo)致培養(yǎng)介質(zhì)中H+數(shù)量增加從而引起pH值下降。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 挑選有機(jī)磷溶量在19.0 μg/mL、無(wú)機(jī)磷溶量在190.0 μg/mL、分泌IAA能力在27.0 μg/mL以上的菌株DosaP15、DosaP25進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

在蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，DosaP15菌落呈污白色，近圓形、半透明或不透明、表面光滑、邊緣整齊、生長(zhǎng)較慢；DosaP25菌落呈淡黃色，近圓形、不透明、表面光滑、中間隆起、邊緣整齊，生長(zhǎng)較快（圖5）。

DosaP15革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，大小為（2.2～2.8）μm×（0.6～0.7）μm，產(chǎn)芽孢；DosaP25革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，兩端鈍圓，多個(gè)排列時(shí)成短鏈，大小為（2.2～3.0）μm×（0.7～0.8）μm，產(chǎn)芽孢（圖6）。

2.2.2 菌株生理生化實(shí)驗(yàn) DosaP15、DosaP25的主要生理生化指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果表明（表3）， 兩者相同點(diǎn)在于運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、過(guò)氧化氫試驗(yàn)為陽(yáng)性，不產(chǎn)氣，可利用葡萄糖、果糖、檸檬酸鹽，液化明膠；在2% NaCl、5% NaCl中均可生長(zhǎng)，5 ℃不生長(zhǎng)，耐受溫度為41 ℃，產(chǎn)芽孢。不同點(diǎn)在于DosaP15 甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性，不能利用乳糖，不可水解淀粉，硫化氫、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性；DosaP25甲基紅試驗(yàn)為陰性，可利用乳糖，水解淀粉，硝酸鹽還原、硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化指標(biāo)，初步判斷DosaP15、DosaP25屬于芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。

2.2.3 16 S rRNA基因序列測(cè)定及分析 將待鑒定菌株16 S rRNA基因測(cè)序所得序列，采用BLAST進(jìn)行同源性比較，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)對(duì)比分析，DosaP15與Bacillus pumilus（JX 102495）同源性達(dá)99%，DosaP25與Bacillus subtilis（KF 831377）同源性達(dá)99%。選取同源性較高的代表菌株，以16 S rRNA基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖7、8）。相比芽孢桿菌屬的其它種，DosaP15與短小芽孢桿菌的遺傳進(jìn)化距離最近，同處一個(gè)最小分支；DosaP25與枯草芽孢桿菌的遺傳進(jìn)化距離最近，同處一個(gè)最小分支。將DosaP15、DosaP25的形態(tài)特征、生理生化測(cè)定指標(biāo)與表4[16-17]進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)DosaP15、DosaP25的主要特征分別與短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌相一致。結(jié)合16 S rRNA序列分析，初步鑒定DosaP15為短小芽孢桿菌、DosaP25為枯草芽孢桿菌。

3 討論與結(jié)論

土壤中磷素循環(huán)以微生物活動(dòng)為中心，微生物活動(dòng)對(duì)土壤磷素的轉(zhuǎn)化影響很大。土壤微生物在植物根系區(qū)間的生態(tài)分布數(shù)量遠(yuǎn)高于非根系土壤區(qū)間。植物的代謝物質(zhì)通過(guò)根系進(jìn)入土壤中，不僅能作為微生物繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，甚至對(duì)一些菌群的生長(zhǎng)起到刺激作用。Kabznelson等[18]和趙小蓉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌在植物根際土壤中的分布數(shù)量比非根際土多出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。

溶磷圈法只能作為初篩解磷微生物的方法，D/d值不能完全反應(yīng)菌株的溶磷量。本研究中，溶磷圈法初篩的D/d值DosaP15（1.89）小于DosaP23（3.0），而DosaP15的無(wú)機(jī)磷溶量（196.47 μg/mL）、有機(jī)磷溶量（25.05 μg/mL）均高于DosaP23（174.32、19.22 μg/mL）。Kucey等[20]研究也證實(shí)了溶磷圈法只能用于初篩解磷菌。另外，不同根際解磷菌株的解磷能力存在較大差異，DosaP25溶解磷酸鈣的量（223.27 μg/mL）是DosaP5（9.23 μg/mL）的24.19倍，DosaP15、DosaP25溶解卵磷脂的量（25.05、19.22 μg/mL）分別是DosaP5（0.43 μg/mL）的58.26、44.70倍。這可能與植物所處的土壤類型、土壤肥力、氣候及植物的年齡、長(zhǎng)勢(shì)等綜合因素有關(guān)。林啟美等[21]研究證實(shí)了不同土壤生態(tài)環(huán)境中解磷菌分布存在較大差異，菜地土壤中有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量是林地、草地、農(nóng)田的10倍。

對(duì)于解磷菌的解磷機(jī)理，尚未有一個(gè)準(zhǔn)確的定論，不同菌株的解磷機(jī)理有所差別。在土壤無(wú)機(jī)磷缺乏的情況下，解磷菌通過(guò)分泌核酸酶、磷酸酶及植酸酶等，溶解有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)磷酸鹽的形式。一般認(rèn)為，解磷菌溶解無(wú)機(jī)磷與自身分泌酸性物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)可降低pH值，能與Al3+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+等離子結(jié)合，從而溶解難溶性磷酸鹽。不同解磷菌株分泌有機(jī)酸的種類存在較大差別，如席琳喬等[22]從棉花根際分離出的解磷菌可分泌酒石酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸，而朱穎[23]從三葉草根際土壤中分離的解磷菌可產(chǎn)草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸。一些解磷菌還可分泌植物激素IAA且不同菌株分泌IAA量存在明顯差異。如DosaP25分泌IAA量是DosaP5的7.05倍；李顯剛等[24]從百脈根根際土壤篩選出11株具有分泌IAA能力的溶磷菌，其中菌株LC20分泌IAA能力是LC5的4.62倍。本研究中菌株的解磷能力、分泌IAA能力與培養(yǎng)介質(zhì)終點(diǎn)pH均無(wú)顯著相關(guān)性，各菌株培養(yǎng)介質(zhì)終點(diǎn)pH與起始pH相比呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組的培養(yǎng)介質(zhì)pH無(wú)明顯變化呈中性或略偏堿性。與趙小蓉等[25]研究發(fā)現(xiàn)解磷菌的溶磷量與培養(yǎng)介質(zhì)pH值及有機(jī)酸分泌量均無(wú)顯著相關(guān)性的結(jié)果相近。菌株的磷酸鈣溶量、卵磷脂溶量、IAA分泌量與培養(yǎng)介質(zhì)終點(diǎn)pH之間的相關(guān)系數(shù)存在如下關(guān)系，R32（0.944）>R12（0.8506）>R22（0.536）。說(shuō)明IAA分泌量與培養(yǎng)介質(zhì)終點(diǎn)pH之間的關(guān)系更為密切，證實(shí)了解磷細(xì)菌通過(guò)分泌一些酸性物質(zhì)，使得質(zhì)子數(shù)量增加導(dǎo)致pH值下降。下一步將對(duì)篩選出的高效解磷菌作進(jìn)一步研究，以用于專用生物復(fù)合肥的研制。

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