宮小明　楊麗君　王洪濤等

摘要[目的]建立動(dòng)物源性食品中均三嗪類藥物及其代謝物殘留的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法。[方法] 采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，建立了動(dòng)物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。[結(jié)果] 地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜4種均三嗪類藥物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2>0.99）。牛粉基質(zhì)中4種化合物在5、10和20 μg/kg加標(biāo)水平的回收率為74.5%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 15.4%～17.5%。[結(jié)論] 該方法穩(wěn)定、可靠，可用于動(dòng)物源性食品中均三嗪藥類物殘留的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞動(dòng)物源性食品；均三嗪類藥物；QuEChERS；液相色譜-高分辨質(zhì)譜

中圖分類號(hào)S851.347文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）28-114-04

Determination of Diclazuril， Toltrazuril and Metabolite Residues in Animalderived Food by Liquid Chromatography—High Resolution Mass Spectrometry

GONG Xiaoming1， YANG Lijun2， WANG Hongtao1 et al

（1.Weifang EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Weifang， Shandong 261041；2.Weihai EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai，Shandong 264200）

Abstract[Objective] The research aimed to establish the detecting method of liquid chromatography—highresolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animalderived food. [Method] The samples were pretreated by using QuEChERS technology and detect by using Exactive liquid chromatography—high resolution mass spectrometry. The detecting method of liquid chromatography—highresolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animalderived food was established. [Result] Diclazuril，toltrazuril and its metabolites showed a good linear correlation in the range of 2.0-50.0 μg/L（r2>0.99）. The average recoveries of these four compounds in beef power at the spiked levels of 2，10，20 μg/kg was 74.5%-90.1%， and the relative standard deviations（RSD）was 15.4%-17.5%. [Conclusion] This method was stable and reliable， and so it could be used for detecting diclazuril， toltrazuril and its metabolites.

Key wordsAnimalderived food； 1，3，5triazine； QuEChERS； Liquid chromatography—highresolution mass spectrometry

20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的均三嗪類抗球蟲藥因其高效、廣譜、毒性低，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中受到了廣泛重視。目前，生產(chǎn)中使用的均三嗪類藥物主要有地克珠利和妥曲珠利，地克珠利和妥曲珠利可以有效殺滅包括球蟲在內(nèi)的多種原蟲，屬于高效抗球蟲藥物，妥曲珠利在動(dòng)物體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。

均三嗪類藥物的檢測(cè)主要有氣相色譜-電子捕獲法、液相色譜-紫外檢測(cè)法[1-3]。近年來(lái)，均三嗪類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法國(guó)內(nèi)外有較多的研究報(bào)道[4-7]，由于分子結(jié)構(gòu)的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無(wú)論在何種碰撞能量下都無(wú)法得到合適的子離子，因此只能選擇其母離子，利用SIM方式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)歐盟2003/181/EC 法規(guī)，低分辨質(zhì)譜母離子只能算1分，遠(yuǎn)低于確證4分的要求[8-9]，因此低分辨質(zhì)譜只用于進(jìn)行篩查，在遇到陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，必須進(jìn)行進(jìn)一步確證。軌道阱高分辨質(zhì)譜儀具有較高的分辨率、掃描速度和靈敏度，可以有效去除基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩選和高可靠性的確證定量分析[10-12]。筆者采用QuEChERS[13-15]技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，建立了動(dòng)物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。通過與低分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的比較，有效避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

1.1.1儀器。

靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Thermofisher Exactive）；萬(wàn)分之一天平（Mettler AE163）；均質(zhì)器（IKA T25）；振蕩器（IKA MS1）；離心機(jī)（Eppendorf 5810）；氮吹儀（NEVAP111）。

1.1.2試劑與材料。

地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜標(biāo)準(zhǔn)品，其化合結(jié)構(gòu)式見圖1，均購(gòu)自于SigmaAldrich公司；乙睛、甲醇、甲酸（色譜純），水為MilliQ超純水，使用前過0.45 μm濾膜；氯化鈉、中性氧化鋁（分析純）；N丙基乙二胺粉（PSA）、二甲基十八碳硅烷粉（ODS），均購(gòu)自于Agela Technologies公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜，用乙腈溶解，準(zhǔn)確定容至100 ml，得到濃度為100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光于4 ℃下保存。使用時(shí)用基質(zhì)空白提取液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。為避免分析物分解，應(yīng)當(dāng)用棕色器皿保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品，置于100 ml塑料離心管中，加入5.0 g無(wú)水硫酸鎂，加入乙腈15 ml，在均質(zhì)機(jī)上高速均質(zhì)2 min左右，10 000 r/min高速離心10 min，取上清9 ml氮吹濃縮，乙腈定容到1.5 ml，加入150 mg ODS吸附劑玻璃試管中，1 400 r/min渦混2 min，離心后取1 ml上清液，氮吹，1 ml初始流動(dòng)相定容，上機(jī)檢測(cè)。

1.4液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1.4.1液相色譜條件。

色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18 柱（3.0 mm ×100 mm，1.8 μm）；柱溫為35 ℃；流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min（10% B），2.5～6.0 min（10%B～90%B），6.0～9.0 min（90%B），10.0～12.0 min（10%B）平衡3 min。

1.4.2質(zhì)譜條件。

全掃描正/負(fù)離子模式，掃描質(zhì)量范圍m/z 200～1 000；分辨率為25 000；掃描速度為4 Hz；自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值為10 e6；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣氣壓為35 Au；輔助氣壓為10 Au；離子源溫度為300 ℃。4種化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1提取條件的選擇

均三嗪類藥物屬于弱極性物質(zhì)，易溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低。筆者分別考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈作為提取溶劑，均可以得到良好的提取效果，乙腈能更有效地沉淀蛋白，減少雜質(zhì)干擾，同時(shí)乙腈也有利于下一步使用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行凈化，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2各種吸附劑粉對(duì)回收率的影響

QuEChERS技術(shù)是2003年由美國(guó)化學(xué)家Steven J.Lehotay和德國(guó)的Michelangelo Anastassiadas[13-14]提出的一種快速、簡(jiǎn)單、低成本的樣品處理方法。該方法采用分散固相萃?。―ispersive-SPE）凈化法，即提取液直接加入吸附劑粉進(jìn)行凈化，經(jīng)離心后上清液上機(jī)檢測(cè)。

為了選擇合適的吸附劑，首先考察各種吸附劑粉對(duì)回收率的影響，取2 ml乙腈溶解的濃度為0.05 μg/ml的4種藥物的混標(biāo)溶液，分別加入150 mg不同的吸附劑，經(jīng)振蕩、離心后，取上清液1 ml，上機(jī)，試驗(yàn)重復(fù)6次，計(jì)算平均回收率。從表2可以看出，ODS對(duì)目標(biāo)物的吸附較少，同時(shí)又可以很好地吸附脂肪酸、維生素、色素、甾醇等雜質(zhì)，因此選擇ODS作為最終的吸附劑。

2.3牛粉樣品高分辨質(zhì)譜與低分辨質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的比較

由于分子結(jié)構(gòu)的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無(wú)論在何種碰撞能量下都無(wú)法得到合適的子離子，因此只能利用選擇離子掃描（SIM）模式對(duì)母離子進(jìn)行檢測(cè)，QuEChERS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速，缺點(diǎn)是凈化效果差，此前利用低分辨三重四級(jí)桿質(zhì)譜在（SIM）模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，可以滿足篩查的要求，但是在遇到復(fù)雜基質(zhì)干擾的情況下，就必須進(jìn)行進(jìn)一步確證。軌道阱高分辨質(zhì)譜儀具有較高的分辨率和靈敏度，可以有效去除基質(zhì)干擾。從圖2可以看出，在妥曲珠利4.3 min左右的出峰時(shí)間，牛粉樣品有一個(gè)明顯的峰；從圖3可以看出，在5.79 min左右妥曲珠利的出峰時(shí)間，牛粉樣品既提取不到妥曲珠利的精確質(zhì)量數(shù)也得不到對(duì)應(yīng)的色譜峰，因此可以判斷牛粉為陰性樣品，低分辨質(zhì)譜下樣品的峰應(yīng)該為雜質(zhì)干擾，為假陽(yáng)性結(jié)果。

2.4線性范圍、定量限、回收率和精密度

用基質(zhì)提取液配制一系列不同濃度的4種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣，以峰面積為縱軸，以濃度為橫軸，繪制校準(zhǔn)曲線，由工作站可直接計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由表3可知，4種分析物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以20 μg/kg空白牛粉添加色譜圖，根據(jù)10倍信噪比計(jì)算定量限，4種化合物的定量限均為2 μg/kg，能滿足日本、歐盟等國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量。

用空白樣品加標(biāo)方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。分別對(duì)牛粉進(jìn)行3個(gè)不同水平的加標(biāo)，每個(gè)水平平行測(cè)定7次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，4種化合物在2、10、20 μg/kg加標(biāo)水平的回收率為74.5%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為15.4%～17.5%。

3小結(jié)

筆者將最先應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留分析的QuEChERS技術(shù)引入地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥及其代謝物殘留分析的樣品前處理過程，針對(duì)妥曲珠利、妥曲珠利砜無(wú)法得到碎片離子，只能采用SIM模式檢測(cè)母離子的特點(diǎn)，借助靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀分辨率、出色的質(zhì)量精度、高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍的特點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，與高效液相色譜法-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法相比可以更好地去除基質(zhì)干擾，靈敏度大大提高。該方法具有適用性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常檢測(cè)分析的要求，應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，取得了滿意的效果。

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