宋麗杰 王麗 王捷

摘要：CRISPR/Cas9系統(tǒng)是原核生物抵御病毒或質(zhì)粒等外來遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)，主要由非特異性的Cas9核酸酶和起識別作用的crRNA所組成。相較于傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)具有快速、簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)，并且?guī)缀蹩梢杂糜谌魏挝锓N的基因編輯。盡管CRISPRJCas9系統(tǒng)的基因組特異性還有待進(jìn)一步確認(rèn)，但該系統(tǒng)在基因組編輯方面的簡便性和有效性必將促進(jìn)生物學(xué)的研究和人類疾病基因治療方面的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：人工核酸內(nèi)切酶：基因編輯：CRISPR/Cas9

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0276-07

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是研究基因功能的一種重要手段，同時也是許多基因相關(guān)疾病的潛在治療方法。早期主要依賴于基因同源重組及體細(xì)胞核移植技術(shù)來完成對特定基因的改造，然而自然情況下基因重組效率極低，且細(xì)胞核移植技術(shù)費(fèi)時費(fèi)力[1，2]，嚴(yán)重制約了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。因此，在不斷尋求高效、簡便的基因編輯方法過程中，人工核酸內(nèi)切酶（engineered endonuclease.EEN）介導(dǎo)的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)快速發(fā)展成為一種主流方法。

人工核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因編輯的第一步是在修飾位點(diǎn)誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。核酸酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的DSBs可借助非同源末端連接（non homologous end-join-ing，NHEJ）機(jī)制或同源重組（homologous recombi-nation，HR）機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。NHEJ將斷裂的雙鏈末端直接連接起來，可有效地引起基因的插入/缺失突變，即inclel突變，從而使基因的功能遭到破壞。當(dāng)引入模板DNA序列時，可通過同源重組修復(fù)（HR），插入或刪除特定的基因序列。通過人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的DSBs，基因突變的幾率大于1010，有時甚至超過50%[3] ，因此，人工核酸內(nèi)切酶被稱為“DNA剪刀”。鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger en-donuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 （Lranscriplion activator-like effector nuclease，TALEN）分別作為第一代和第二代“DNA剪刀”，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成。但由于這兩種人工核酸內(nèi)切酶制備復(fù)雜，成本昂貴，難于開展大規(guī)模基因編輯的篩選，使其應(yīng)用有所局限。近年來，細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalinclromic repeats）的應(yīng)用使得基因組編輯技術(shù)進(jìn)一步簡化.CRISPR/Cas9作為第3代人工核酸內(nèi)切酶迅速成為目前研究的熱點(diǎn)，其獨(dú)特性和靈活性在于該系統(tǒng)是通過RNA介導(dǎo)核酸酶與靶DNA序列結(jié)合的。與以DNA結(jié)合蛋白為基礎(chǔ)的ZFN和TATJFJN相比，以RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理更加簡單，只需要遵循RNA與DNA之間的堿基互補(bǔ)配對原則。

本文重點(diǎn)介紹了CRISPR/Cas9的作用機(jī)理及其應(yīng)用，最后就CRISPR/Cas9技術(shù)目前存在的問題及其應(yīng)對策略進(jìn)行了探討。

1 CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

CRISPR廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，是細(xì)菌和古細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以介導(dǎo)外源DNA的降解，從而抵御病毒等外來入侵者[4，5]。1987年，日本學(xué)者首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)該間隔重復(fù)序列[6]；2002年，Jansen等[7，8] 將其正式命名為CRISPR，基因編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為CRISPR附屬蛋白（CRISPR-associa七ion pro-teins，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有Type I、TypeⅡ、TypeⅢ3種不同類型，其中研究最多、應(yīng)用最廣的是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。產(chǎn)膿鏈球菌（Strepto-coccus pyogenes SF370）的Ⅱ型CRISPR基因座主要由三部分組成，包括Cas9核酸酶基因、不編碼蛋白質(zhì)的tracr RNA基因和CRISPR基因（圖1），其中CRISPR基因由前導(dǎo)序列（leader sequence）、間隔序列（ spacers）和重復(fù)序列（repeats）組成[9] 。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫主要分為3個步驟。首先是新的間隔序列的獲?。和鈦碣|(zhì)?；虿《綝NA首次入侵時，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)將外來DNA整合入CRISPR重復(fù)序列之間形成一段新的間隔序列，并隨著宿主DNA -起編碼；其次是crRNA的表達(dá)、加工與成熟：CRISPR重復(fù)序列和間隔序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工為pre-crRNA，tracrRNAs與pre-crRNA的重復(fù)序列區(qū)域配對雜交，然后內(nèi)源性的RNaseⅢ從每一個間隔序列的5'端裂解雜合的pre -crRNA -tracrRNAs，產(chǎn)生成熟的tracr-RNA-crRNAs，并與Cas9核酸酶結(jié)合[10] ；最后，當(dāng)同樣的外源DNA再次出現(xiàn)時，CRISPR-Cas復(fù)合體可與雙鏈DNA的靶位點(diǎn)結(jié)合并切割雙鏈。靶標(biāo)的識別和DNA鏈的裂解既需要間隔序列和靶序列之間的互補(bǔ)，又需要靶DNA序列3'端存在PAM （Protospacer adjacent motif）序列[11]，PAM序列的存在還避免了CRISPR基因本身被作為靶標(biāo)識別，提供了一個識別“自己”和“異己”的機(jī)制。不同的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)有不同的PAM序列，基于產(chǎn)膿鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的PAM序列為NGG，N指的是任意核苷酸[10] 。

Cas9實(shí)際上是一種核酸酶，它具有兩個獨(dú)立的核酸酶位點(diǎn)：一是HNH核酸酶位點(diǎn)，可以斷裂與crRNA互補(bǔ)的那條鏈；另一個是類似于RuvC核酸酶位點(diǎn)，可以裂解另一條非互補(bǔ)鏈。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)Cas9家族的所有成員都具有相同的結(jié)構(gòu)核心，這個結(jié)構(gòu)核心的特征為一種具有兩個主葉（major lobe）-核酸酶結(jié)構(gòu)域葉和a-螺旋葉的結(jié)構(gòu)，其中核酸酶結(jié)構(gòu)域葉是由HNH結(jié)構(gòu)域、RuvC結(jié)構(gòu)域以及與PAM序列相互作用的C末端結(jié)構(gòu)域組成。這兩個主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結(jié)合中發(fā)揮功能。Cas9蛋白本身以非活性的狀態(tài)存在，它的核酸酶活性被C末端結(jié)構(gòu)域的方向所抑制，而且不能與DNA結(jié)合；但當(dāng)其與crRNA-tracrRNA復(fù)合體結(jié)合時，這種蛋白的兩個主葉之間就會構(gòu)建出一條作為DNA結(jié)合界面發(fā)揮功能的通道，從而在結(jié)構(gòu)上激活Cas9，使得它能夠與靶DNA結(jié)合，PAM序列則將其核酸酶活性激活[12—14]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

目前，來自于產(chǎn)膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)已被改造為基因組定點(diǎn)編輯的工具。該系統(tǒng)具備兩個最基本的成分：一個是起識別作用的cr-RNA-tracrRNA序列，另一個是起切割作用的Cas9核酸酶。在對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯時，需要對Cas9蛋白編碼基因進(jìn)行優(yōu)化以及添加合適的核定位信號；此外，還需考慮是分別表達(dá)crRNA和tracrRNA還是嵌合成一條crRNA -tracrRNA，crRNA -tracrRNA又稱向?qū)NA（ gR-NA）c15]。

自2012年首次證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割不同的DNA[10]以來，該系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、番茄、擬南芥、大米、小麥、高粱、鼠、兔子、青蛙、果蠅、蠶、線蟲、斑馬魚及人類細(xì)胞等的基因編輯中[3]。與其他人工核酸酶相比.該RNA介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)一個顯著的優(yōu)勢就是可以同時在多個不同的DNA位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。例如，Cas9和多個gRNAs的同時表達(dá)，可在DSBs間造成大片段的刪除和插入[16，17]；可在鼠細(xì)胞中同時誘導(dǎo)3個基因的突變[18]；在斑馬魚體細(xì)胞中導(dǎo)致5個基因的同時突變等[19]。

Cas9除了可以用于基因的編輯外，還可以對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)Cas9核酸酶的兩個催化位點(diǎn)全部突變時，Cas9就變成了沒有核酸酶活性的蛋白質(zhì)（稱為dCas9）；研究表明，dCas9可以結(jié)合在基因的啟動子上來抑制基因的表達(dá)[20，21]。當(dāng)gRNA結(jié)合在啟動子的上游時，無論其結(jié)合在DNA的哪條鏈上，dCas9都可以有效地抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；然而，當(dāng)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游時，只有當(dāng)gRNA結(jié)合在非模板鏈時，dCas9才能起抑制作用[20]。此外，dCas9還可以作為一個平臺招募各種效應(yīng)因子結(jié)合在特異的基因位點(diǎn)上。例如，在人類細(xì)胞[22-25]和小鼠細(xì)胞[2q中，結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子或者轉(zhuǎn)錄抑制子的dCas9可以對基因的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用（圖2A）。并且，如果有2—10個gRNA介導(dǎo)多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在同一基因位點(diǎn)，可以進(jìn)一步提高基因調(diào)節(jié)的效率，推測與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用相關(guān)[22，23，26，27]。也有研究利用EGFP-dCas9融合物來識別包含重復(fù)序列的DNA位點(diǎn)，例如端粒[28]（圖2B），若DNA位點(diǎn)包含有重復(fù)序列，則會結(jié)合有多個EGFP蛋白，為研究染色體的動力學(xué)和結(jié)構(gòu)提供了一種有力的手段，并且使Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用不僅局限于基因的表達(dá)范圍。

這種簡便高效的CRISPR/Cas9技術(shù)填補(bǔ)了哺乳動物細(xì)胞內(nèi)基于基因完全敲除而進(jìn)行的大規(guī)?；蚬δ苄院Y選方法的空白，可以針對細(xì)胞全部基因或某些基因構(gòu)建gRNA文庫，然后經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)行大規(guī)模的篩選。已有研究團(tuán)隊(duì)針對人類的部分291個基因構(gòu)建了包含有869種gRNA的文庫，并且成功地鑒別出了對于炭疽和白喉毒素毒性事關(guān)重要的宿主基因[29]。也有研究報道針對人類或小鼠的全部基因組構(gòu)建了包含有64 000～87 000條gRNA的文庫，通過高通量的敲除技術(shù)對人類和小鼠細(xì)胞進(jìn)行了基因的功能性篩選鑒定[30-32]。其技術(shù)路線大致相同，都是通過構(gòu)建gRNA慢病毒表達(dá)載體來感染細(xì)胞，然后通過功能性篩選鑒定細(xì)胞，最后經(jīng)過二代基因測序[33] 確定相關(guān)的基因。不同之處在于，有的團(tuán)隊(duì)[31]將gRNA和Cas9串聯(lián)表達(dá)在同一個慢病毒表達(dá)載體上，通過感染將二者一次性轉(zhuǎn)入細(xì)胞；而有的團(tuán)隊(duì)[30，32] 將二者分別克隆在不同的載體上，先獲得穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞，然后再進(jìn)行g(shù)RNA慢病毒的感染。盡管RNA干擾（RNA interference，RNAi）文庫[34]也曾被廣泛應(yīng)用于功能缺失型基因篩選，但是與gRNA文庫相比，RNA干擾只是下調(diào)某些基因的表達(dá)，常常造成不穩(wěn)定的表型變化，并且文庫構(gòu)建繁瑣，價格昂貴；而gRNA文庫的構(gòu)建和篩選都非常的簡單，在基因的功能性篩選鑒定方面發(fā)揮了重要作用。

除此之外，CRISPR-Cas系統(tǒng)也可以用來快速地建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動物模型。一些人類疾病例如糖尿病、心臟病、精神分裂癥是與多個基因有關(guān)的，CRISPR多基因同時編輯的特點(diǎn)為這些疾病模型的建立提供了很好的方法[35，36]。利用傳統(tǒng)方法建立動物疾病模型要花費(fèi)1年多的時間，而使用CRISPR技術(shù)只需幾周即可完成。而且，傳統(tǒng)方法只能用于傳統(tǒng)動物的建模，靈長類動物體內(nèi)基因精確修飾一直是個難題，但最近一個研究小組在猴子體內(nèi)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了精確的基因修飾[37]為我們提供了一種研究人類疾病的新策略。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及提高特異性的策略

脫靶效應(yīng)幾乎是所有基因定點(diǎn)編輯技術(shù)所面臨的一個主要問題。在CRISPR/Cas9所介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯中，由于Cas9能夠“容忍”gRNA與靶序列之間的錯配，因此可能會導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，從而在非靶位點(diǎn)產(chǎn)生不需要的突變。為了評估CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，幾個研究小組設(shè)計(jì)出與靶序列互補(bǔ)區(qū)域有1—4個核苷酸錯配的gR-NA，然后再檢測這些gRNA能否介導(dǎo)Cas9在報告基因[38] 或內(nèi)源性基因中發(fā)揮基因編輯作用[16 39]。研究結(jié)果表明，當(dāng)錯配堿基比較靠近gRNA的5端時，gRNA仍能夠介導(dǎo)Cas9的結(jié)合與切割，但當(dāng)錯配堿基比較靠近gRNA的3'端時，該系統(tǒng)就失去了基因編輯功能；提示靶基因3 '端的8～12個堿基對gRNA的識別起著關(guān)鍵作用。然而，僅根據(jù)錯配堿基在靶序列的位置并不能準(zhǔn)確判斷單個或兩個核苷酸錯配所造成的影響，一些靠近3'端的錯配也可能不會影響Cas9的活性[38]。另外，Cas9在不同的細(xì)胞類型中脫靶效應(yīng)可能也不同，有研究小組[40，41]在人類多能干細(xì)胞中利用CRISPR進(jìn)行基因編輯，然后利用全基因組測序法檢測整個基因組，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)，在多能干細(xì)胞中的特異性非常高，幾乎沒有脫靶效應(yīng)。

盡管RNA介導(dǎo)Cas9核酸酶的特異性機(jī)制并不完全清楚，但是已有研究開始探索減少脫靶效應(yīng)的方法，其中一個策略就是減少gRNA和Cas9在細(xì)胞中的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)gRNA和Cas9表達(dá)量減少之后，雖然脫靶效率明顯降低，但靶位點(diǎn)的突變也出現(xiàn)了下降[38]。所以在實(shí)際應(yīng)用時需要權(quán)衡脫靶效應(yīng)和打靶效應(yīng)之間的關(guān)系，確定一個最佳的gRNA和Cas9的表達(dá)量。

另一個提高該系統(tǒng)特異性的方法是使用成對的切口酶，在Cas9的RuvC或NHN核酸酶位點(diǎn)引入DlOA或H840A的突變[42] ，形成只切割靶DNA一條鏈的Cas9切口酶，并且這種酶在某些位點(diǎn)引起的HR基因修復(fù)的幾率要大于NHEJc'5， 161。使用兩個gRNAs和Cas9切口酶在靶位點(diǎn)的臨近區(qū)域產(chǎn)生兩個切口[27，43，44]，可以有效地產(chǎn)生缺失突變，該種方法已經(jīng)被許多研究應(yīng)用。由于單個Cas9切口酶也可以在特定的基因位點(diǎn)產(chǎn)生插入缺失突變，因此在基因編輯時為使兩個切口酶互相“依賴”于對方，即一個切口酶只有在與另一個切口酶靠得很近時才會有基因編輯的能力，可將一個形成二聚體時才有活性的核酸酶例如FokI融合到無核酸酶活性的dCas9上[45，46] 那么當(dāng)兩個dCas9-gRNA聚合在一起時就可以產(chǎn)生二聚體Fokl，并且可以對DNA雙鏈進(jìn)行切割，這樣就實(shí)現(xiàn)了dCas9的協(xié)同性作用。研究表明只有當(dāng)Fokl核酸酶連接在Cas9蛋白的N端時才會起切割作用，并且對成對靶位點(diǎn)的PAM序列的方向也有要求，即只有當(dāng)2個PAM序列在成對的gRNA的外側(cè)時才有活性（圖2C）。也許正是反應(yīng)條件的苛刻性才使得其特異性大大提高，其打靶效率與脫靶效率的比值是原始的CRISPR系統(tǒng)的140倍[45] 。

最近有研究小組發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)可以僅僅通過縮短gRNA的長度來降低，縮短的區(qū)域是與互補(bǔ)序列的5'端對應(yīng)的位置[47]。這些縮短了的gRNA是由17或18個核苷酸組成的（稱為“tru -gR-NAs”）；它們與全長的gRNA相比，不會造成靶位點(diǎn)的突變效率下降，但是脫靶效應(yīng)明顯降低，并且對gRNA與DNA之間1個或2個核苷酸之間的錯配更加敏感。這種方法與成對的切口酶方法相比，不會遇到在一個細(xì)胞中表達(dá)多個gRNA的技術(shù)難題；tru-gRNA也可以與其他提高Cas9特異性的方法共同發(fā)揮作用，例如，tru-gRNA可以與成對切口酶共同使用來提高Cas9的特異性。

現(xiàn)有研究表明RNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶的脫靶效應(yīng)的發(fā)生幾率是可變的，并且很難預(yù)測。對于任意一個給定的靶位點(diǎn)，目前很難預(yù)測有多少錯配是能夠“容忍”的，也沒有完全明白為什么有些位點(diǎn)能夠被切割，而有些則不能被切割。盡管有證據(jù)證明DNA甲基化并不會抑制Cas9的基因組編輯[39]，但是染色體的結(jié)構(gòu)似乎對脫靶效應(yīng)起了一定的作用。為了更加全面深入地了解Cas9的脫靶效應(yīng)，需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)的評價細(xì)胞中Cas9特異性的方法。

4展望

RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其簡便性、高效性和經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。CRISPR/Cas9作為第3代人工核酸酶，突破了模式生物的限制，可以在更多的物種中進(jìn)行高效的遺傳操作，并且建立的gRNA文庫可以高通量地對基因進(jìn)行功能性篩選，使得反向遺傳學(xué)可以在任何感興趣的有機(jī)體或細(xì)胞中進(jìn)行。此外，免費(fèi)的軟件使得設(shè)計(jì)gRNA的成本為零，可以方便靈活地設(shè)計(jì)合適的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。現(xiàn)有研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用于治療一些與基因相關(guān)的疾病[48] ，但將其應(yīng)用于臨床之前仍有許多技術(shù)障礙需要克服。首先，Cas9編碼系統(tǒng)在體內(nèi)必須能夠有效地轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞當(dāng)中。然而，Cas9蛋白相對分子質(zhì)量很大，常用的來自產(chǎn)膿鏈球菌的Cas9蛋白的氨基酸就多達(dá)1 368個[49] 。為使Cas9蛋白基因能夠有效地插入病毒載體（例如腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒），可以通過刪除與蛋白功能無關(guān)的基因來人工構(gòu)建低相對分子質(zhì)量的Cas9蛋白。除了基因轉(zhuǎn)入方面的問題，CRISPR/Cas9用于基因治療最大的障礙是Cas9的特異性。當(dāng)用于大量細(xì)胞時，即使Cas9具有很高的特異性，也很難完全避免由于脫靶效應(yīng)而帶來的危害。此外，如何避免不利的免疫反應(yīng)也很重要，一個有效的方法是Cas9的相關(guān)肽片段的人源化。最后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因缺陷疾病的治療也需要其他相關(guān)技術(shù)的支持，如安全有效、特異性強(qiáng)的體內(nèi)載體的開發(fā)。

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用于臨床之前還面臨著很多困難，但它可將RNA、DNA和蛋白質(zhì)聚集在一起的性質(zhì)，以及其簡便、高效和多個靶位點(diǎn)同時編輯的特點(diǎn)預(yù)示著其有望用于臨床相關(guān)疾病的治療，相信隨著CRISPR/Cas9及其相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，將會對人類遺傳性疾病的治療產(chǎn)生巨大的影響。