祖克拉·肉孜 宋曼殳 布帕提瑪穆·阿布都克熱穆 伊力哈木·乃扎木

多力坤·買買提玉素甫

摘 要：對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體基因（PPARG）的31個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，利用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)PPA RG基因的31個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型，統(tǒng)計(jì)分析31個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布頻率，利用x2檢驗(yàn)確定篩選的SNP位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)31個(gè)SNP位點(diǎn)中，23個(gè)位點(diǎn)的次等位基因分布頻率MAF≥0.05，在新疆維吾爾族人群中具有多態(tài)性，其他8個(gè)SNP位點(diǎn)的MAF< 0.05，沒(méi)顯示多態(tài)性?；蛐秃偷任换蝾l率在男女兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），表明這些位點(diǎn)等位基因分布不存在性別差異。

關(guān)鍵詞：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPA RG）；SNP位點(diǎn)；維吾爾族人群

中圖分類號(hào)：Q39

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0189-07

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）是指人類基因組中單個(gè)堿基的變異，推測(cè)人類基因組至少有210萬(wàn)個(gè)SNPs[1]。SNPs是人類種族差異、個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)，成為第三代多態(tài)性標(biāo)記，是基因組多樣性和識(shí)別及定位疾病相關(guān)基因的一種新型手段[2]。SNPs數(shù)量大、分布廣，在人類30億堿基中有約3x106個(gè)SNPs位點(diǎn)，在任何已知或未知疾病基因附近都可能找到眾多的SNPs[1]。應(yīng)用高密度的SNPs圖譜，通過(guò)相關(guān)分析或連鎖分析可以定位一系列多基因疾病，如糖尿病、高血壓、哮喘、癌癥等的主基因。因此，人們希望通過(guò)研究SNP圖譜，更深刻地認(rèn)識(shí)癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等發(fā)病率高的多基因疾病的發(fā)生機(jī)制[2，3]。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPA RG基因定位于3p25，屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，主要表達(dá)于脂肪組織，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程，參與脂肪細(xì)胞的凋亡，PPA RG基因功能缺失突變可以導(dǎo)致脂肪萎縮，在脂肪細(xì)胞特異基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面發(fā)揮著重要作用[4]。PPA RG也可能成為肥胖、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化的新型治療靶點(diǎn)[5-9]。研究提示其可能在脂肪細(xì)胞分解、能量消耗及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4，10-14]。目前認(rèn)為PPA RG在人體能量代謝的調(diào)節(jié)控制中起核心作用，直接影響到葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)、葡萄糖胺生成速率和組織的糖異生能力，經(jīng)大樣本薈萃分析顯示單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與2型DM易感性相關(guān)[15-19]。

至今雖然在不同種族報(bào)道了PPARG基因多態(tài)性方面的很多關(guān)聯(lián)研究，但研究結(jié)果不一致，且研究位點(diǎn)多集中于少數(shù)幾個(gè)常見(jiàn)SNP有報(bào)道。為此，本研究探討新疆維吾爾族健康人群PPA RG基因的31個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，為進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與相關(guān)疾病發(fā)病危險(xiǎn)性和前瞻性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本

采自在新疆地區(qū)民豐縣縣醫(yī)院體檢的健康維族人群無(wú)關(guān)個(gè)體50例，要求所有調(diào)查對(duì)象均在所在地區(qū)居住3代以上，無(wú)血緣關(guān)系，年齡>40歲，家庭婚姻史為世代族內(nèi)通婚。自肘靜脈采血3 mL加0.5 mL ACD抗凝，充分混勻后放人-20°C冰箱冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑和儀器

基因擴(kuò)增：ABI Gene Amp@9700 384 Dual，質(zhì)譜點(diǎn)樣：Mass ARRAY Nan dispenser RS1000；質(zhì)譜分析：Mass ARRAY Compact System；試劑：Complete Genotyping Reagent Kit for Mass AR-RAY@ Compact 384。

1.3方法及步驟闡述

1）基因組DNA提取及DNA樣品濃度和純度質(zhì)檢：采用北京Transgenic Biotech有限公司的EasyPureTM Blood Genomic DNA Kit試劑盒。分離出的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260 /OD28080數(shù)值，調(diào)整DNA終濃度在30～50 ng/μL之間。 2）引物設(shè)計(jì)及引物稀釋：根據(jù)SNP位點(diǎn)通過(guò)美國(guó)Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；通過(guò)質(zhì)譜預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行延伸引物質(zhì)檢，將引物稀釋到質(zhì)譜反應(yīng)所需濃度。PCR引物儲(chǔ)備液制備：配置PCR引物儲(chǔ)備液，終濃度為100 μmol/L；單堿基延伸引物儲(chǔ)備液制備：配置單堿基引物儲(chǔ)備液，終濃度為500 μmol/L；引物設(shè)計(jì)詳細(xì)（見(jiàn)表2）。

3） PCR反應(yīng)：5μL的PCR反應(yīng)體系中含有ddH20 1.8 μL，10* buffer 0.5μL，Mg2+ 0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hot star 0.2μL，F(xiàn) Primer/R Primer 1μL，基因組DNA樣品（20—50 ng），至終體積5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性，95 0C 30 s，56 0C 30 s，72 0C 60 s*45個(gè)循環(huán)；72 0C 5 min；25 aC∞。

4） SAP酶消化反應(yīng)：按照下述順序配制SAP酶Mix：總體積2x460，dddH20 1.53x460pLL，SAP Buffer 0.17x460 μL，SAP Enzyme 0.3x460μL，下一步在PCR儀中按照下述程序進(jìn)行SAP酶消化：37 0C 40 min，85 0C 5 min，25 0C ∞。

5）單堿基延伸反應(yīng)：按照下述順序配制單堿基延伸反應(yīng)Mix：三蒸水0.619x460 μL，lOx iplex buffer 0.2x460 μL，Terminator mix 0.2x460μL.引物0.94x460 μL，單堿基延伸酶0.041x460 μL，至終體積2x460 μ1。下一步在PCR儀中按照下述程序進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)：預(yù)變性94℃30 s，分別為94 °C 5 s，52℃Ss進(jìn)行40個(gè)外部循環(huán)，分別為80 °C 5 s，72 0C 3 min進(jìn)行40個(gè)內(nèi)部循環(huán)，25 °C ∞。

6）樹(shù)脂純化：將反應(yīng)產(chǎn)物的384孔板中加入16 μL三蒸水，在離心機(jī)中離心2 000轉(zhuǎn)離心3 min；加入樹(shù)脂，在反轉(zhuǎn)搖勻儀上做樹(shù)脂純化反應(yīng)35 min，脫鹽；反應(yīng)完成后在離心機(jī)中離心2 000轉(zhuǎn)離心3 min。將脫鹽處理后的樣品點(diǎn)在樣品靶上，自然結(jié)晶。

7）進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，并收集數(shù)據(jù)：MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）反應(yīng)；Typer 4.0軟件檢測(cè)質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所有完成的問(wèn)卷統(tǒng)一編碼，使用SPSS Data Entry 2.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)。所選SNP位點(diǎn)群體基因型經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用直接計(jì)數(shù)法對(duì)各個(gè)SNP位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群中的頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率分布特征的比較。

2 結(jié)果

1） SNP位點(diǎn)借于MAF值進(jìn)行Hardy -Wein-berg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。

一般以P=0.05作為顯著性水平的界值，P>0.05說(shuō)明所調(diào)查的群體達(dá)到遺傳平衡，即本次群體調(diào)查的數(shù)據(jù)可信；SNP分子標(biāo)識(shí)的選擇依據(jù)：①最小等位基因頻率（MAF）≥0.05；②PPARG與多代謝異常有關(guān)的SNP；③所選的SNP位于基因片段功能區(qū)或可能改變功能的區(qū)域[19J。X2檢驗(yàn)中自由度的法則為：由于總的理論數(shù)必須等于總的實(shí)際數(shù)（作為限制條件，必須從總的自由度中減1），需要估計(jì)的參數(shù)實(shí)際上只有等位基因頻率a，其余等位基因和全部基因型頻率都可以由其推算出，所以需要估計(jì)的參數(shù)數(shù)目為1，df=總的分類數(shù)（即基因型的數(shù)目）一1（需要估計(jì)的參數(shù)數(shù)目1。PPA RG基因所篩選的SNPs位點(diǎn)中除了rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs -9870196、rs17036700、rs4135304、rs4135343位點(diǎn)以外，其他23個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性（P>0.05）（見(jiàn)表1）。

2）對(duì)新疆地區(qū)50例維吾爾族無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行SNP分型檢測(cè)獲得31個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。

采用直接記數(shù)法計(jì)算，得到每個(gè)位點(diǎn)的最小等位基因頻率（MAF）。rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs9870196、rs17036700位點(diǎn)第1個(gè)等位基因頻率為1，第2個(gè)等位基因頻率都為0。rs4135304、rs4135343位點(diǎn)第1個(gè)等位基因頻率為0，第2個(gè)等位基因頻率都為1（見(jiàn)表3）。

3）進(jìn)一步對(duì)具有多態(tài)性的23個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因型頻率分布計(jì)算。

在23個(gè)SNP位點(diǎn)中，rs1899951、rs2292101、rs-2881654、rs1801282等位點(diǎn)的第一個(gè)純合體基因型頻率最高，頻值0.74，rs6782475、rs7626560等位點(diǎn)的第一個(gè)純合體基因型頻率最低，頻值均為0。在雜合體中rs17036242、rs7615916、rs9310401等位點(diǎn)的雜合體基因型頻率最高，頻值分別為0.60、0.63、0.60。rs6782475位點(diǎn)雜合體基因型頻率最低，頻值均為0.12。在第2個(gè)純合體中，rs3856806、rs6782475等位點(diǎn)的基因型頻率最高，頻值分別為0.68、0.88。rs17036242、rs1899951、rs-2292101、rs2881654、rs9310401、rs1801282等位點(diǎn)基因型頻率最低，頻值均為0—0.02（見(jiàn)表4）。

4）采用SPSS軟件X2檢驗(yàn)進(jìn)行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率計(jì)算。

在rs2292101位點(diǎn)第2個(gè)純合體的基因型在男和女都為0，所以無(wú)法進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，rs6782475、rs7626560位點(diǎn)第一個(gè)純合體的基因型在男和女都為0，所以無(wú)法進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，其他位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在男女組間的差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)表5）。

3討論

過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體y（PPA R-y），也稱胰島素增敏劑受體，是一種位于人類染色體上的二型核受體，由PPARG基因編碼，對(duì)脂肪細(xì)胞和胰島素有重要的作用，是治療糖尿病的研究對(duì)象之一[16-22]。PPA R-y通過(guò)JAK -STAT、激活蛋白-1（AP-1）、NF-rd3、活化T細(xì)胞核因子信號(hào)通路（NFAT）來(lái)抑制炎癥反應(yīng)；通過(guò)抑制泡沫細(xì)胞的分化、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；通過(guò)磷脂酰肌醇三激酶（P13K）、瘦素、脂鏈素等信號(hào)通路來(lái)參與糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)；通過(guò)細(xì)胞周期的調(diào)控來(lái)影響腫瘤生長(zhǎng)；參與脂肪細(xì)胞分化并與肥胖密切相關(guān)。明確這些相關(guān)信號(hào)通路以及相關(guān)細(xì)胞因子的作用，可對(duì)相關(guān)疾病機(jī)制及防治進(jìn)一步提供有力依據(jù)和干預(yù)途徑[23]。

代謝綜合征是臨床上具有肥胖、高血壓、血脂紊亂、受損的糖耐量或糖尿病以及胰島素抵抗等一系列代謝失常癥狀的并稱，是多種代謝成分異常聚集的的病理狀態(tài)。引起上述代謝失常癥狀的因素有很多，包括胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、脂肪組織分泌的各種細(xì)胞因子的參與、生活方式及遺傳因素等，但其根本原因還是能量代謝的失衡[24-26]。因此，代謝綜合征治療手段的探索和相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究中，從新疆維吾爾族人群50例無(wú)關(guān)個(gè)體提取血液DNA，使用Haploview 4.1分析軟件，對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（ PPARG）相關(guān)SNP位點(diǎn)篩選，為了避免由于SNP的MAF過(guò)低而產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)偏倚，首先考慮納入（最小等位基因）MAF>0.05的多態(tài)位點(diǎn)，并根據(jù)多人群研究情況選擇熱點(diǎn)多態(tài)性位點(diǎn)優(yōu)先進(jìn)入候選分型。結(jié)果顯示，篩選的31個(gè)位點(diǎn)中rs1151999、rs1175540、rs17036242、rs1875796、rs1899951、rs2292101、rs -2881654、rs2921190、rs2938397、rs2959272、rs295 -9273、rs2972162、rs3856806、rs4135247、rs4135275、rs4684846、rs6782475、rs709151、rs7615916、rs76 -26560、rs9310401、rs9817428、rs1801282等23個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性。在男女組間23個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率差異均沒(méi)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

目前，我們只是對(duì)以上SNP位點(diǎn)在新疆維吾爾族人群的多態(tài)性特征進(jìn)行了調(diào)查，為進(jìn)一步的群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)，并為今后進(jìn)行疾病前瞻性研究提供了重要的基礎(chǔ)資料，但是，這些位點(diǎn)與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的相關(guān)性如何，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1] 王娟.人類基因組SNPs的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].生命科學(xué)（WANG Juan. Prospects and progress on single nucleotide polymorphisms in human genome[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences）， 2006，18（4）： 397-401.

[2] 陳菁，孫桂芹.單核苷酸多態(tài)性在多基因遺傳病研究中的作用[J]中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志（CHEN Jing ，SUN Gui-qin. The role of single nucleotide polymorphisms in the study of che complex genetic diseases[J]. Chinese Medical Journal），2007，4（19）： 229-

231.

[3] 張奎星，劉同寶，徐秋霞，血管緊張素Ⅱ1型受體基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和冠心病的相關(guān)研究[J].中華心血管病雜志 （ZHANG Kui-xing， LIU Tong-bao，XU Qiu-xia.Association of angiotensin II receptor type l gene nucleotide polymorphism with Chinese essential hypertension complicated with coronary heart disease[J]. Chinese Journal of Cardiology），2005，8（33）： 720-723.

[4] 唐新，林嬰，黃文芳.PPA RG基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病血脂異常的相關(guān)性研究[J]檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)（TANG Xin LIN Ying， HUANG Wen-fang. The investigation of relationship between PPARC gene single nucleotide polymorphism andblood lipid abnormality in patients with type 2 diabel，ic mellitus[J].Laboratory Medic，ine），2009，3（24 ）：190-193.