王彥婷 黃智剛 郭西英 汪盛

摘要：真核生物的許多蛋白富含二硫鍵。由于大腸桿菌細胞質(zhì)中含有二硫鍵還原酶，利用大腸桿菌生產(chǎn)具有生物活性的重組二硫鍵蛋白充滿挑戰(zhàn)。近年來，SHuffle菌株、超氧化性細胞的相繼問世，利用分子伴侶或引入二硫鍵從頭形成體系，使多二硫鍵蛋白在大腸桿菌中的表達成為可能。簡要概述了野生型大腸桿菌細胞周質(zhì)和經(jīng)遺傳改造的工程茵細胞質(zhì)中二硫鍵的形成機制，并著重介紹了近年來重組二硫鍵蛋白表達策略的最新研究進展，對利用大腸桿菌反應(yīng)器生產(chǎn)富含二硫鍵蛋白起指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：二硫鍵蛋白：大腸桿菌；Dsb蛋白；分子伴侶；巰基氧化酶；超氧化性細胞

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0258-07

蛋白質(zhì)在細胞的各種生命活動中扮演了重要的角色，如信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細胞粘附等。20世紀70年代，DNA重組技術(shù)的應(yīng)用，使蛋白質(zhì)能在多種宿主細胞中表達[1]?？傮w上，高產(chǎn)率重組蛋白的獲得比較困難且不可預(yù)計，尤其是目標蛋白存在翻譯后修飾，如形成二硫鍵。真核生物內(nèi)的二硫鍵蛋白普遍存在，對人類基因組的預(yù)測表明，大約30%的蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而其中一半數(shù)量含有二硫鍵[2]。二硫鍵可在構(gòu)象上固定多肽鏈的骨架或改善其熱動力學(xué)穩(wěn)定性，以抵抗高溫、強酸、強堿等傷害。因此，二硫鍵蛋白常被分泌到細胞外或錨定于細胞膜，它們適于作為治療藥物（如胰島素、抗體）或制藥產(chǎn)業(yè)的靶標蛋白[3]。工業(yè)化生產(chǎn)及科學(xué)研究也需要大量的活性蛋白。

真核細胞（酵母、昆蟲、中國倉鼠卵巢細胞）表達二硫鍵蛋白，時間長且花費大，而無細胞表達體系難以實現(xiàn)擴大化生產(chǎn)。大腸桿菌是目前首選宿主菌之一，因其具備生長快、操作簡單、產(chǎn)量高等特點備受人們青睞[3]。大腸桿菌中二硫鍵蛋白的形成定位于細胞周質(zhì)，但蛋白產(chǎn)率低。而大腸桿菌細胞質(zhì)缺乏真核蛋白表達所需的翻譯后加工機制，因此多數(shù)二硫鍵蛋白在細胞質(zhì)中形成包涵體。蛋白包涵體只能通過變性、復(fù)性等過程獲取一定比例的活性蛋白，且方法繁瑣、產(chǎn)率低下、通用性不強。因此如何改善大腸桿菌細胞的表達環(huán)境以獲得高產(chǎn)率的活性二硫鍵蛋白，是科學(xué)家們致力于解決的難題。本文介紹了大腸桿菌中二硫鍵的形成機制，并綜述近年來二硫鍵蛋白表達策略的最新研究成果，為富含二硫鍵蛋白在大腸桿菌反應(yīng)器的重組表達或工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 大腸桿菌細胞周質(zhì)二硫鍵的形成

1.1周質(zhì)蛋白分泌機制

多數(shù)大腸桿菌分泌蛋白首先被合成蛋白前體。它們的信號肽由Sec分子識別，根據(jù)信號肽的種類，Sec機制分為翻譯后和共翻譯轉(zhuǎn)運兩種方式。在前者，細胞質(zhì)內(nèi)的伴侶分子SecB與前體蛋白結(jié)合，并維持蛋白的未折疊狀態(tài)直至接觸移位酶。而共翻譯轉(zhuǎn)運方式是在翻譯過程中蛋白的信號肽由信號識別顆粒（signal recognition particle，SRP）識別，整個SRP-核糖體一新生多肽復(fù)合物再與Sec移位酶結(jié)合[4] 。少數(shù)分泌蛋白采取一種雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（lwin arginine translocation system，Tac），該系統(tǒng)轉(zhuǎn)運蛋白的信號肽帶有特征性雙精氨酸基序。與Sec機制不同，Tal系統(tǒng)中蛋白以緊密折疊形式經(jīng)過細胞膜。該系統(tǒng)可能與細菌產(chǎn)生抗生素耐藥性有關(guān)[4] 。

1.2 DsbA/DsbB氧化系統(tǒng)

轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì)的多肽由Dsb蛋白（Ds-bA-DsbG）催化形成二硫鍵。肽鏈半胱氨酸的硫醇鹽陰離子首先親和攻擊DsbA的活性中心，并與DsbA形成分子間二硫鍵中間體。該中間體很不穩(wěn)定，由肽鏈另一個硫醇鹽陰離子親和攻擊而快速釋放，肽鏈形成二硫鍵，DsbA被還原[5]。

還原態(tài)DsbA經(jīng)DsbB的重新氧化實現(xiàn)活性再生，而DsbB則通過電子傳遞系統(tǒng)再被氧化。DsbB是細胞內(nèi)膜蛋白，它具有4個跨膜螺旋的核心區(qū)相兩段暴露于細胞周質(zhì)的柔性區(qū)。DsbB有兩對二硫鍵，其柔性區(qū)的二硫鍵首先從DsbA獲得電子，再傳遞給跨膜區(qū)附近的半胱氨酸對[6] 。該對二硫鍵被還原后，其中一個半胱氨酸可與輔因子醌的芳環(huán)形成電荷傳遞復(fù)合體。有氧條件下，電子經(jīng)細胞色素bo、bd氧化酶傳遞給氧氣分子，而缺氧時，電子的最終受體改變，由甲基萘醌將電子傳給延胡索酸或硝酸鹽等[7] （圖1）。

1.3 DsbC/DsbD異構(gòu)化系統(tǒng)

DsbA參與二硫鍵形成反應(yīng)是快速且非特異的，它傾向于催化順序排布的半胱氨酸對形成二硫鍵。因此蛋白存在多對非連續(xù)性二硫鍵時，就容易發(fā)生錯誤配對，其在細胞內(nèi)積累或被降解[9]。大腸桿菌存在相應(yīng)的糾錯機制一周質(zhì)中的二硫鍵異構(gòu)酶DsbC，可識別并幫助錯誤折疊蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)。

體內(nèi)的DsbC是兩個亞基組成的同源二聚體，整體呈V形。每個亞基具有二聚體化和硫氧還蛋白兩個功能域，它們依靠一段短的螺旋區(qū)連接。DsbC共有4個半胱氨酸，硫氧還蛋白功能域C端的兩個半胱氨酸形成二硫鍵，穩(wěn)定DsbC的空間結(jié)構(gòu)[10]。N端的半胱氨酸對是DsbC的活性中心，它們具有CXXC催化模序，并由DsbD維持還原狀態(tài)。DsbD是細胞內(nèi)膜蛋白，它包含3個模塊：跨膜功能域DsbDp，細胞周質(zhì)功能域Dsb Dcv和Dsb-Dy。每個功能域有一對活性半胱氨酸。DsbDβ的半胱氨酸對首先從細胞質(zhì)硫氧還蛋白獲取電子，再傳遞到DsbDγ功能域，然后經(jīng)DsbDα最終將電子傳遞給DsbC[11]（圖1）。DsbD及其家族蛋白是目前已知的一類將電子從細胞質(zhì)膜傳遞到細胞周質(zhì)的氧化還原酶。

事實上，DsbC并不是DsbD的唯一底物。DsbG為DsbC的同源類似物，它具有CXXC催化模序，由DsbD維持還原態(tài)。最新研究發(fā)現(xiàn)[12]除了異構(gòu)酶活性，細胞周質(zhì)的DsbG還發(fā)揮還原酶作用。某些周質(zhì)蛋白存在單一半胱氨酸，它們暴露于氧自由基環(huán)境易生成次磺酸，或被進一步氧化成磺酸而損害蛋白活性。DsbG表面的負電荷區(qū)域適于識別已折疊蛋白，并作為周質(zhì)還原系統(tǒng)的關(guān)鍵因子防止蛋白的單一半胱氨酸遭受氧化損傷。而DsbC內(nèi)部排列的疏水氨基酸，似乎更利于它與未折疊蛋白作用并糾正錯配二硫鍵。另外，DsbC也可作為DsbG功能的替補[12] 。

2大腸桿菌細胞質(zhì)二硫鍵的形成

2.1 野生型菌株細胞質(zhì)的還原途徑

大腸桿菌細胞質(zhì)的還原環(huán)境不利于蛋白的氧化。Derman等[13] 的開創(chuàng)性工作首先闡明了大腸桿菌細胞質(zhì)中兩條主要的還原途徑。一條是硫氧還蛋白途徑：包括硫氧還蛋白TrxA和TrxC，并由硫氧還蛋白還原酶TrxB維持還原態(tài)；另一條是谷氧還蛋白途徑：其核心是谷胱苷肽還原酶（Glu-tathione reductase），它能還原GshA和GshB兩種酶，這兩類酶與細胞質(zhì)還原型谷胱甘肽（glu-tathione，GSH）的形成有關(guān)。在細胞質(zhì)中，GSH可直接參與二硫鍵的還原反應(yīng)，它首先與底物形成中間體復(fù)合物，再由一種谷氧還蛋白（Grxl，Grx2，Grx3）使中間體釋放，生成還原態(tài)底物和氧化態(tài)谷氧還蛋白，后者又在GSH作用下重新恢復(fù)還原態(tài)[14] 。兩條電子傳遞網(wǎng)絡(luò)的還原電勢均來自細胞質(zhì)NADPH池[目（圖2）。

2.2突變菌株細胞質(zhì)的氧化途徑

在研究野生型菌株細胞質(zhì)還原途徑時，Der-man等[13]發(fā)現(xiàn)，同時缺失兩個核心基因trxB和gor的菌株無法存活，但這種致死性可祓細胞質(zhì)內(nèi)過氧化物酶AhpC突變抑制。AhpC*突變體具有二硫鍵還原酶活性，它能在細胞質(zhì)中富集還原態(tài)Grxl，保證菌株活力[15] 。trxB的缺失使細胞質(zhì)內(nèi)氧化型硫氧還蛋白TrxA、TrxB積累，它們可催化形成二硫鍵。此突變株被稱為FA113 （trxB，gor， ah-p C'）[8]，商業(yè)名稱是Origami。利用Origami使膠原4-脯氨酰羥化酶在細胞質(zhì)的表達量遠高于野生型BL21的細胞周質(zhì)[16] 。此外，該氧化型細胞質(zhì)也用于富集功能性脂肪酶B、神經(jīng)生長素的Ig2功能域及幾丁質(zhì)酶等[17]。

（trxB，gor-）菌株雖然可實現(xiàn)蛋白的氧化折疊，但其細胞質(zhì)缺乏二硫鍵異構(gòu)化途徑。Bessette等I1SI研究發(fā)現(xiàn)，DsbC在細胞質(zhì)過量表達可有效提高二硫鍵蛋白的活性產(chǎn)率。在體外的無細胞體系，它也有同樣效果[19]。受此啟發(fā)，2012年，Lobstein等[3] 基于（trxB-，gor-）菌株，將dsbC基因插入嚴格控制的細菌rRNA轉(zhuǎn)錄啟動子rrnB下游，使DsbC在細胞質(zhì)穩(wěn)定且過量表達，改造菌株命名為SHuffle，（圖3）。他們比較了3種多二硫鍵蛋白：熒光素酶（Gaussia， luciferase，Gluc）、尿激酶、組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，vtPA）在SHuffle中的表達活性，認為該菌株促進蛋白折疊具有底物特異性。但SHuffle仍成為表達二硫鍵蛋白的新選擇，如Tait等[20]利用SHuffle表達人皰疹病毒膜蛋白U24，其產(chǎn)量可比普通的BL21（DE3）細胞提高4.3倍。

2.3 DsbC在蛋白二硫鍵折疊中的研究

在細胞質(zhì)或周質(zhì)中表達二硫鍵蛋白是否需要DsbC的輔助，這與二硫鍵的形成機制有關(guān)。在細胞周質(zhì)，DsbA首先向未折疊多肽引入二硫鍵，它傾向于催化順序排布的半胱氨酸對的氧化。比較而言，（trxB-，gor-）突變體細胞質(zhì)的二硫鍵形成機制尚不明確。但與周質(zhì)中未折疊多肽不同，Kramer等[21]報道核糖體可促進新生肽鏈形成二級結(jié)構(gòu)，合成蛋白在核糖體通道出口處或已存在部分折疊。這利于氧化酶催化肽鏈形成正確的二硫鍵，因而降低了細胞質(zhì)蛋白折疊對DsbC的依賴。這似乎可解釋尿激酶在細胞周質(zhì)表達時的活性完全依賴DsbC，而在細胞質(zhì)表達對DsbC的依賴性僅為50%[8]。

DsbC在某些情況下對細胞質(zhì)蛋白表達非常有利。例如，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled re-ceptors，GPCRs）是最著名的藥物靶標分子家族，一直以來備受科學(xué)家關(guān)注。B類GPCR的細胞外功能域（extracellular domain，ECD）包含3對保守的二硫鍵，為蛋白的獲取及結(jié)構(gòu)解析帶來了較大困難。2008年，Pioszak等[22]將人類甲狀旁腺素受體的ECD構(gòu)建到MBP融合體系，并與DsbC在Origami細胞質(zhì)內(nèi)共表達。然后利用目標蛋白與DsbC在體外谷胱甘肽緩沖液中孵育，進行蛋白二硫鍵重排反應(yīng)。他們最終獲得正確折疊的樣品，解析出該蛋白結(jié)構(gòu)。隨后，利用此體系他們先后成功表達了皮質(zhì)激素釋放因子受體[23]和垂體腺苷酸環(huán)化酶受體[24]。

3 多二硫鍵蛋白在大腸桿菌中的表達策略

隨著大腸桿菌細胞中二硫鍵形成機制的深入揭示，很多理論廣泛應(yīng)用于真核生物二硫鍵蛋白表達。特別是近年來人們不斷探尋新的方法和體系，使大腸桿菌表達多二硫鍵蛋白的研究取得了較多成果。

3.1分子伴侶輔助二硫鍵蛋白折疊

一般地，肽鏈經(jīng)過疏水塌縮、空間盤曲、側(cè)鏈聚集等折疊過程形成其天然構(gòu)象。二硫鍵的形成和肽基脯氨酰鍵異構(gòu)化是其中的限速步驟。經(jīng)典的“自組裝學(xué)說”認為，肽鏈氨基酸序列包含了蛋白折疊所需的全部信息。隨著研究深入，Emsc251的“輔助性組裝學(xué)說”提出體內(nèi)肽鏈的折疊需要分子伴侶的輔助。分子伴侶可為二硫鍵形成等限速步驟提供較長的折疊時間，促進蛋白組裝成自然狀態(tài)。

3.1.1 周質(zhì)分子伴侶輔助二硫鍵蛋白表達

細胞周質(zhì)的分子伴侶包括FkpA、Skp、DegP、SurA等。FkpA是一類通用的折疊增強子，兼具分子伴侶與肽基脯酰胺順反異構(gòu)酶（peptidyl-propyl cis-trans isomerase，PPIase）活性。它是V型的同源二聚體，每個亞基的N端參與二聚體化或具有分子伴侶活性，C端為PPIase功能域。FkpA以二聚體界面形成的疏水口袋結(jié)合底物，并促進柔性C端接近底物脯氨酰鍵[25]。它的PPIase活性催化某些穩(wěn)定的反式肽基脯氨酰鍵，異構(gòu)成功能蛋白所必需的順式構(gòu)型。目前已發(fā)現(xiàn)的PPIase分屬于3個蛋白家族：親環(huán)素、FK506結(jié)合蛋白以及細小菌素蛋白[4]。

SurA與細小菌素蛋白類型的PPIase具有同源性，它最早從細菌抵抗饑餓脅迫中被鑒定。SurA的空間構(gòu)象賦予其分子伴侶活性。它的外形類似非規(guī)則的啞鈴狀，其核心模塊有一個較深的口袋，偏愛識別含Ar-X-Ar基序的底物。Ar指芳香族氨基酸，X指任意氨基酸[26]。其余分子伴侶，如Skp通常捕獲由Sec分泌機制轉(zhuǎn)運的未折疊多肽。DegP是HtrA絲氨酸蛋白酶家族的第一位成員，它用于清除細胞周質(zhì)變性或聚集蛋白，其分子伴侶或蛋白酶活性受溫度調(diào)控[26] 。

因細胞周質(zhì)獨特的氧化環(huán)境，可將某些二硫鍵蛋白分泌于周質(zhì)中表達。但是分泌效率的不可控性以及周質(zhì)Dsb蛋白、分子伴侶含量偏低，帶來了活性蛋白產(chǎn)量不高等問題。在過表達的分子伴侶協(xié)助下，蛋白折疊效率增加，活性產(chǎn)率可能提高。2011年，Schlapschy等[27]將FkpA、SurA以及DsbA、DsbC共同構(gòu)建成新型輔助質(zhì)粒pTUM4，使4種折疊酶在細胞周質(zhì)中過表達，提高了分泌蛋白的折疊效率。另外，篩選提升目標蛋白分泌效率的菌株類型也是必要的，如JM83、HM125、KS272等。Schlapschy已利用pTUM4輔助了多種二硫鍵蛋白的表達，包括惡性瘧原蟲表面蛋白48/45，樹突細胞特異性細胞間黏附分子-3-結(jié)合的非整合素以及各種抗原結(jié)合片段等[27]。

3 .1.2 細胞質(zhì)分子伴侶增加二硫鍵蛋白可溶性

相比細胞周質(zhì)，大腸桿菌細胞質(zhì)中存在更多的分子伴侶，與折疊相關(guān)的分子伴侶系統(tǒng)包括三類[2q：觸發(fā)因子（trigger factor，TF）、DnaK-Dnaj-GrpE和GroEL-GroES，細胞質(zhì)中，短的新生多肽首先與核糖體結(jié)合的TF相互作用，隨著肽鏈延伸，長鏈多肽由DnaK捕獲。DnaK的N端功能域水解ATP供能，協(xié)助C端完成多肽的折疊。共伴侶素DnaJ可上調(diào)DnaK的ATP酶活性，而增強DnaK與底物的結(jié)合力。另一共伴侶素GrpE通過催化ATP/ADP交換反應(yīng)介導(dǎo)底物釋放。除非底物已完成折疊，否則它可能將被傳遞給下游的GroEL-GroES系統(tǒng)。GroEL與共伴侶素GroES形成“折疊籠”結(jié)構(gòu)[28]，為底物進一步折疊提供良好的環(huán)境。

在大腸桿菌細胞質(zhì)，多數(shù)重組蛋白受控于強啟動子，它們的表達水平通常較高。但宿主細胞自身的分子伴侶含量或許無法滿足新生肽鏈正確折疊的需求，導(dǎo)致目標蛋白可溶性降低，甚至形成包涵體。共表達分子伴侶可能有效輔助二硫鍵蛋白折疊，增加蛋白可溶性。例如，Kyratsous等[29]設(shè)計DnaK與GroEL的融合載體，在大腸桿菌細胞質(zhì)中獲得了鼠類朊蛋白的可溶產(chǎn)物。另外，共表達DnaKJ可防止鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白CorA形成包涵體[30]，或提高人類粒系集落刺激因子（human granulo-cyte colony stimulating factor，hG-CSF）在細胞周質(zhì)的表達量[31] 。

3.2 融合標簽輔助二硫鍵蛋白表達

除了分子伴侶，利用Dsb蛋白與目標蛋白融合表達，也可促進二硫鍵正確形成。目前，已有包含Dsb蛋白的商業(yè)化載體供選擇，如pET-39（Ds-bA）、pET-40（DsbC）。另外，一些細胞質(zhì)融合標簽，如MBP（maltose -binding protein）、NusA（N-Utiliza-tion substance）、TRX（thioredoxin）等也被廣泛使用。MBP由大腸桿菌K12的malE基因編碼，它能增加融合蛋白的溶解性。而且MBP不含半胱氨酸，避免了與目標蛋白半胱氨酸形成錯配二硫鍵的問題。MBP已成功應(yīng)用于真核細胞蛋白以及人工合成的單鏈抗體（single-chain antibody fragment，scFv）的可溶表達[32] 。Houry等[33] 揭示NusA是分子伴侶GroEL在體內(nèi)的必須底物。所以NusA可能招募分子伴侶幫助蛋白折疊。另一種TRX標簽可防止細胞質(zhì)蛋白聚集沉淀，甚至挽救錯折疊的多二硫鍵肽鏈，如槲寄生毒素、豬胃蛋白酶原A舊等。TRX維持蛋白穩(wěn)定性的機制尚不清楚，但它可能依賴伴侶活性輔助scFv的折疊，理由是突變其催化中心的半胱氨酸，它仍能促進活性scFv的表達[17] 。

3.3二硫鍵從頭形成體系促進蛋白表達

自然界中二硫鍵的形成可以在三類細胞內(nèi)隔室中完成，真核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體內(nèi)膜空間以及原核細胞的細胞周質(zhì)。相對于這些細胞隔室，大多數(shù)野生型原核細胞質(zhì)幾乎觀察不到二硫鍵蛋白的存在。Derman等舊通過（trxB， gor， ahpC）的突變，首先實現(xiàn)了大腸桿菌細胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)二硫鍵蛋白。

在（trxB，gor-）工程菌中，細胞質(zhì)硫氧還蛋白參與硫醇一二硫鍵的交換反應(yīng)，即它依靠還原底物（如核苷酸還原酶）而將二硫鍵轉(zhuǎn)移到其他蛋白（如堿性磷酸酶）中，硫氧還蛋白本身不能催化二硫鍵從頭形成。所以O(shè)rigami等生產(chǎn)的蛋白實為某些代謝途徑的副產(chǎn)物，蛋白產(chǎn)率普遍偏低[34]。

3.3.1 Ervlp體系在二硫鍵蛋白表達中的應(yīng)用

細胞內(nèi)隔室的情況相反，它們存在二硫鍵從頭形成的催化酶，如巰基氧化酶，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Erol、釀酒酵母線粒體內(nèi)膜空間的Ervlp等。如果向大腸桿菌細胞質(zhì)引入二硫鍵從頭形成體系，可能會大幅提高活性蛋白的產(chǎn)率。但是，此類巰基氧化酶不是直接作用于底物，它們需要媒介蛋白的輔助，如Erol依賴PDI，Ervlp依賴Mia40等[34]。另據(jù)文獻報道，黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adeninedinucleotide，F(xiàn)AD）存在時，釀酒酵母的Ervlp可能獨立于Mia40，直接利用氧氣分子催化巰基形成二硫鍵[35] 。另外，人們發(fā)現(xiàn)沒有任何輔因子時，Ervlp能有效地使變性牛胰胰蛋白酶抑制劑（含兩對二硫鍵）重新恢復(fù)自然狀態(tài)[34] 。因此Ervlp可能是一種單獨的催化二硫鍵從頭形成的氧化酶。

利用這一特性，2010年Hat.ahet等[34] 將釀酒酵母的Ervlp引入野生型大腸桿菌細胞質(zhì)，首次獲得比（trxB-， gor-）菌株產(chǎn)率更高的活性目標蛋白。他們的結(jié)果不僅顛覆了長久以來野生型原核細胞質(zhì)不能產(chǎn)生二硫鍵的普遍觀點，還使人們認識到蛋白的氧化折疊除與反應(yīng)環(huán)境相關(guān)，還與催化酶類有關(guān)。隨后，Nguyen等[3q報道，利用預(yù)表達體系可進一步提高Ervlp對蛋白氧化的促進效應(yīng)。但同時還需要融合標簽防止折疊中間體聚集。他們通過在細胞質(zhì)預(yù)先表達Ervlp與二硫鍵異構(gòu)酶，使活性vtPA（含有9對二硫鍵）的產(chǎn)量比過去僅依靠DsbC共表達時提高800倍以上。另外，該體系也可應(yīng)用于分子間二硫鍵蛋白，如人類抵抗素（Resiscin）是一種抑制脂肪細胞攝取糖分的激素，成熟的Resistin含有5對二硫鍵，并依靠1對分子間二硫鍵形成同源二聚體。以往的表達體系難以獲得可溶的或均質(zhì)蛋白，利用上述方法顯著提高Resistin同型二聚體的產(chǎn)率。由此可見，這類巰基氧化酶似乎可以促進多二硫鍵蛋白的高效表達。

3.3.2 QSOX體系在二硫鍵蛋白表達中的應(yīng)用

另一類靜息巰基氧化酶（quiescin-sulfhydryloxidase，QSOX）是目前已知的唯一具有多功能域的氧化酶。QSOX包括兩個類似硫氧還蛋白的功能域、富含螺旋的間隔區(qū)以及FAD結(jié)合功能域。與其他單功能域巰基氧化酶Erol，Ervl等類似，QSOX可催化二硫鍵的從頭形成，且具有更強的氧化能力[37] 。利用這一特點，20 12年Abskharon等[38] 報道了一種新的大腸桿菌表達體系，他依靠人源重組靜息巰基氧化酶（HsQSOX），在細胞質(zhì)中成功獲得具有生物活性的朊蛋白。

隨后研究人員針對QSOX催化二硫鍵形成展開了深入研究。2014年Zhang等[39]將QSOX與PDI在Origami B細胞質(zhì)中融合表達，構(gòu)建了一種超氧化性細胞（superoxidizing cells）。他們以一類新近報道的對氧化還原敏感的綠色熒光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein， roGFP）監(jiān)鋇0細胞內(nèi)疏基一二硫鍵氧化還原電位，發(fā)現(xiàn)新型超氧化細胞的細胞質(zhì)氧化還原電位為-196 mV，比哺乳動物或酵母細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（約為-230 mV）還高。因此，這種超氧化性細胞非常利于二硫鍵的形成，明顯提高富含二硫鍵蛋白Gluc、vtPA等的氧化折疊效率，為利用大腸桿菌異源表達真核生物多二硫鍵蛋白提供了新策略。

4展望

蛋白的氧化折疊除了具有熱力學(xué)、動力學(xué)基礎(chǔ)之外，還涉及復(fù)雜的分子體系，所以它是一個難以解決的科學(xué)問題。如果蛋白還存在二硫鍵、糖基化等修飾，其表達折疊將更加復(fù)雜和難以控制。雖然近年來，人們利用（trxB-，gor-）工程菌株、超氧化性細胞或者二硫鍵從頭形成體系，已成功地在大腸桿菌中表達多種二硫鍵蛋白。但是這些方法存在局限性，它們或許只適用于小范圍的蛋白。隨著生產(chǎn)、研究的發(fā)展，人們越來越需要更多新型、通用的二硫鍵蛋白表達菌株或體系，這將是一個富有挑戰(zhàn)性的課題。但值得一提的是，2014年Georgescauld等[28] 發(fā)表的研究成果解析了分子伴侶輔助蛋白折疊組裝的作用機制，這為科學(xué)家們理解蛋白折疊的分子機制帶來了巨大幫助。同時，這些理論成果也有助于優(yōu)化已有的方法策略，或為研發(fā)高效的二硫鍵蛋白表達體系創(chuàng)造新的契機。