劉超 張俊 姚正培 倪志勇 陳全家

摘要：根據(jù)棉纖維發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表達(dá)譜分析結(jié)果，從海島棉（新海21）中篩選到一個與棉纖維發(fā)育相關(guān)的黃烷酮3-羥化酶基因（GbF3H）。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼區(qū)長1107bp，編碼368個氨基酸，多序列比對發(fā)現(xiàn)GbF3H序列保守性較高，具有典型的2-酮戊二酸雙加氧酶結(jié)構(gòu)域。實時定量PCR分析表明，GbF3H基因在纖維發(fā)育的不同時期中均有表達(dá)，在開花后Sd的胚珠中表達(dá)量最高，推測GbF3H基因可能對棉纖維發(fā)育具有重要作用。

關(guān)鍵詞：海島棉；黃烷酮3-羥化酶基因；序列分析；基因表達(dá)

中圖分類號：S562.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-3143（2015）03-0007-06

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2015.03.002

O 引言

類黃酮（flavonoids）是一類廣泛分布在植物體內(nèi)的次生代謝物，是植物器官中色素的主要成分。它保護(hù)植物減弱UV-B和外界環(huán)境帶來的氧化損傷，并且在花粉管萌發(fā)、種子休眠和生長素運輸中起到重要作用。類黃酮的合成涉及酶的種類繁多，但主要分為3種：酮戊二酸-依賴的雙加氧酶類、細(xì)胞色素P450羥化酶類和NADPH依賴的還原酶類。其中酮戊二酸一依賴的雙加氧酶類黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）作為類黃酮合成途徑中的核心酶，最早在矮牽牛中被證實，其功能是將黃烷酮羥基化，形成二氫黃酮醇，參與花青素的形成，最終可決定花色。該基因的缺陷性突變體是從金魚草中獲得，突變后可使花色變淡。

棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其體內(nèi)富含的大量次生代謝物在棉纖維發(fā)育及抗逆抗病的過程中發(fā)揮著重要作用。早在構(gòu)建的第一個棉纖維cDNA文庫中，就發(fā)現(xiàn)參與類黃酮代謝的基因在纖維的伸長期和次生壁合成期有顯著上調(diào)表達(dá)，并且在棕色棉中類黃酮代謝的相關(guān)基因也有顯著上調(diào)。通過抑制類黃酮合成途徑的其中一個F3H基因，在花瓣色素生物合成和纖維的發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)F3H不僅決定著纖維的質(zhì)量（如纖維長度和馬克隆值），也影響著纖維顏色（棕色纖維）的發(fā)育。

為探明黃烷酮3-羥化酶基因在類黃酮合成途徑中對棉纖維發(fā)育的影響，本研究根據(jù)海島棉纖維具有長、細(xì)、強的特點與陸地棉形成明顯對比，并針對陸地棉和海島棉的轉(zhuǎn)錄組高通量測序（Solexa）結(jié)果，對陸地棉和海島棉轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行數(shù)據(jù)差異比較分析，篩選得到一個海島棉胚珠棉纖維發(fā)育表達(dá)明顯的基因GbF3H，利用生物信息學(xué)方法對GbF3H基因進(jìn)行分析，并通過實時熒光定量PCR進(jìn)一步分析其開花后在陸地棉與海島棉中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明黃烷酮3-羥化酶在棉花纖維發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海島棉（新海21號）和陸地棉（新陸中36號）播種于試驗田，棉花盛花期分別取開花當(dāng)天（0 DPA）的胚珠和開花后5、10、15和25不同天數(shù)DPA的纖維組織，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 按TRIzol試劑（TIANGEN）說明，提取棉纖維發(fā)育不同時期的組織總RNA。使用DNase I（TIANGEN）去除潛在的DNA污染。cDNA第一鏈的合成按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）說明書完成。

1.2.2 GbF3H基因cDNA序列克隆及分析 根據(jù)NCBI登錄的海島棉GbF3H（Gene Bank ID：DQ912945）基因的cDNA序列設(shè)計引物（表1），以開花后5d棉纖維cDNA為模板，擴增基因序列。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min后，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃再延伸10min，4℃保存。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒（TIANGEN）純化目的片段，將目的片段連接至PMD19-T（TaKaRa）載體，通過轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送上海生工生物公司測序。利用Prot-Param程序（http：//web.expasy.org/protparam/）推測氨基酸的基本性質(zhì)，CDD程序?qū)ふ冶Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域（http：//ww-w.ncbi.nlm.nih. gov/cdd/），BlastP檢索獲得同源序列，Clustal W輸出同源比對結(jié)果，Espript在線分析蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 GbF3H基因的DNA序列克隆 按照基因組DNA試劑盒（TlANGEN）說明書提取新海21葉片DNA，用引物（表1）進(jìn)行PCR擴增、克隆并測序（方法同1.2.2）。用GSDS在線軟件（http：//gsdsl.cbi.pku.edu.cn/in-dex.php）分析確定GbF3H基因中內(nèi)含子的插入位點和長度。

1.2.4 實時定量PCR分析 利用實時定量PCR方法，以開花當(dāng)天（0 DPA）的胚珠和開花后不同天數(shù)（5、10、15和25DPA）CDNA為模板，檢測GbF3H和GhF3H基因在胚珠和不同發(fā)育時期棉纖維中的表達(dá)差異。根據(jù)基因序列設(shè)計定量引物（見表1），使用Life公司的7500 Fast Real PCR System實時熒光定量PCR儀，以SYBRGreen（TaKaRa）為熒光染料，進(jìn)行實時定量分析。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。以棉花UBQ7為內(nèi)參基因，采用2^-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實驗采用3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 GbF3H基因ORF序列克隆及分析

從海島棉中獲得的GbF3H基因序列編碼區(qū)長1107bp（見圖1），編碼368個氨基酸，預(yù)測分子量約為41.424kDa，等電點為5.28。蛋白二級結(jié)構(gòu)中a螺旋占34.78%，延伸序列占21.2%，自由卷曲占44.02%（見圖2）。同源序列比對表明，海島棉GbF3H與陸地棉GhF3H（ABM64799）的氨基酸序列同源性高達(dá)99.46%，僅相差兩個氨基酸（52E-K和339V-L），進(jìn)一步將可可（Theobroma cacao，XP-007046697）、荔枝（Litchichinensis，AD095201）、龍眼（Dimocarpus longan，AB048521）、橄欖（Canarium album，AE036935）、顯齒蛇葡萄（Ampelopsin grossedentata，AFN70721）、柚子（Citrus maxima，ADB92595）這些物種的F3H氨基酸序列進(jìn)行多重比對，發(fā)現(xiàn)F3H蛋白高度保守，都具有2一酮戊二酸雙加氧酶結(jié)構(gòu)域。

2.2 GbF3H基因DNA序列分析

以新海21基因組DNA為模板，克隆到GbF3H基因組序列，用GSDS在線軟件分析確定GbF3H基因全長168lbp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子（見圖3）。3個外顯子的長度分別為357bp、432bp和318bp（圖中淡色標(biāo)記部分）。第一個內(nèi)含子的長度為488bp，第二個內(nèi)含子長度為86bp，分別插入在L119氨基酸之后和H263氨基酸之后。

2.3 基因的表達(dá)特性

為了揭示F3H基因在海島棉和陸地棉胚珠和不同發(fā)育時期棉纖維中的表達(dá)情況，以棉花UBQ7為內(nèi)參基因定量分析表明，F(xiàn)3H基因在胚珠和各纖維發(fā)育時期中都有表達(dá)，且在SDPA的棉纖維中表達(dá)量達(dá)到最高，說明F3H基因在棉纖維發(fā)育起始階段發(fā)揮著一定的功能。隨著纖維的發(fā)育進(jìn)入伸長期，到次生壁開始加厚，GbF3H和GhF3H基因的表達(dá)都呈現(xiàn)下降趨勢，較陸地棉而言，海島棉GbF3H下降幅度更為明顯（圖4）。

3 結(jié)論與討論

類黃酮合成途徑中的黃烷酮3-羥化酶（F3H）屬于依賴2一酮戊二酸的雙加氧酶家族，同時需要Fe²⁺、分子氧、抗壞血酸鹽及2-酮戊二酸作為輔助因子參與催化反應(yīng)。F3H蛋白氨基酸中的H217、H275和D219是Fe²⁺的結(jié)合位點，R285是2-酮戊二酸的結(jié)合位點（圖2），這些氨基酸殘基在酶發(fā)揮生物學(xué)功能時起重要作用。近幾十年的研究工作中，已確定了許多重要的纖維發(fā)育相關(guān)因素。然而，相關(guān)的機制在很大程度上仍然未知。當(dāng)前以大規(guī)模轉(zhuǎn)錄分析和其他組學(xué)研究為基礎(chǔ)，為深入了解、研究相關(guān)機制帶來了方便。

關(guān)于F3H的深入研究，絕大多數(shù)集中在其色素生物合成功能方面，發(fā)現(xiàn)棉花的F3H參與花色及纖維顏色的形成，并且在棕色棉纖維中的表達(dá)水平明顯高于白色棉纖維中。本文針對海島棉和陸地棉在纖維品質(zhì)上差異，通過挖掘公開數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到一個與類黃酮生物合成代謝相關(guān)的黃烷酮3-羥化酶基因。通過定量分析表明，黃烷酮3-羥化酶參與纖維發(fā)育，特別是纖維發(fā)育的初期，F(xiàn)3H基因的表達(dá)明顯上調(diào)，并且GbF3H的表達(dá)量高于GhF3H；而在纖維發(fā)育的中后期，F(xiàn)3H基因在海島棉中的表達(dá)水平低于陸地棉，可能在纖維的品質(zhì)方面起到負(fù)調(diào)控的作用。由圖4可知，棉花F3H基因在2個棉種的纖維發(fā)育的次生壁加厚期（10-25DPA）表達(dá)逐漸下降，在海島棉中尤為明顯。主要的表達(dá)差異在纖維發(fā)育的初期（5DPA），這與徐州142和其突變體的纖維發(fā)育比較中，優(yōu)先發(fā)現(xiàn)類黃酮的基因在胚珠纖維細(xì)胞中表達(dá)25結(jié)果相同，這可能說明黃烷酮3-羥化酶是纖維細(xì)胞發(fā)育中介導(dǎo)該通路的關(guān)鍵因素。

總而言之，次生代謝物黃烷酮3-羥化酶可能參與棉纖維的發(fā)育，具體的影響機制有待進(jìn)一步研究。今后如若采用有效的方法控制類黃酮合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，可為改善纖維品質(zhì)提供新的途徑。