劉堃 陳劍 陳勝峰 吳萍 丁磊 羅凱坤 毛覺生 王國清

摘要：雌核發(fā)育抗病草魚在養(yǎng)殖過程中已表現(xiàn)出較好的抗病能力，但對其抗病力的確定還缺乏有力的證據(jù)。通過對雌核發(fā)育抗病草魚和相同飼養(yǎng)條件下普通草魚的主要免疫球蛋白基因（lgD、IgZ和IgM）相對表達量、免疫生化指標（白蛋白、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和肌酐）、血清溶茵酶活性等相關參數(shù)的比較，分析了雌核發(fā)育抗病草魚的免疫能力。數(shù)據(jù)顯示雌核發(fā)育抗病草魚IgZ、IgM mRNA在血液和脾臟中的相對表達量、IgD mRWA在頭腎和脾臟中的相對表達量都與普通草魚存在顯著差異（P<0.05）；溶菌酶活性與普通草魚存在顯著差異（P<0.05）。在免疫生化指標方面，雌核發(fā)育抗病草魚也明顯優(yōu)于普通草魚。研究結果肯定了雌核發(fā)育抗病草魚在免疫機能方面的優(yōu)越性。

關鍵詞：雌核發(fā)育草魚；免疫；免疫球蛋白（Ig）；溶菌酶

中圖分類號：Q955 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）03-0213-05

草魚（Ctenopharyngodon， idellus）是我國“四大家魚”之一，它具有生長速度快、肉質好、容易養(yǎng)殖等特點，因其飼料來源廣，故極適合在廣大農村養(yǎng)殖[1]。但是草魚抗病能力較差，特別是在一齡、二齡階段。據(jù)統(tǒng)計：在全國范圍內，當年魚苗養(yǎng)殖平均成活率不超過50%，而二齡草魚養(yǎng)殖發(fā)病率又很高，常給養(yǎng)殖戶帶來重大的經(jīng)濟損失。雖然多年來科技工作者一直致力于草魚疾病預防與治療的研究，但因其抗病力差，并未從根本上解決草魚養(yǎng)殖中病害多、死亡率高的難題。湖南師范大學魚類發(fā)育生物學團隊在四倍體鯉鯽[2]的研制基礎上開展了雌核發(fā)育抗病草魚[3，4]的培育和育種研究，從目前江蘇省實際養(yǎng)殖情況分析，與普通草魚相比，雌核發(fā)育抗病草魚養(yǎng)殖成活率提高50%，生長速度快10%～15%。

國內學者對于草魚抗病方面的研究已經(jīng)有了較多的報道。李耀國等[5]和蘇建明等[6]做了關于轉基因抗病草魚研究進展的報道。黃貝等[7]對斜帶石斑魚（Einephelus coioides）IgM、IgZ和IgD蛋白重鏈基因的克隆進行了探究。關于雌核發(fā)育抗病草魚多方面免疫機能與普通草魚比較的報道尚屬罕見。此外，對于培育的各種抗病魚類，目前還缺少一個全面、準確的免疫性能評估體系。本文從免疫球蛋白基因相對表達量、免疫生化指標和血清溶菌酶活性等方面對抗病草魚的免疫性能進行了較為全面的研究，并與同等條件下的普通草魚進行了分析對比，發(fā)現(xiàn)了雌核發(fā)育抗病草魚在免疫機能方面的優(yōu)越性。研究結果可為該品種后期的推廣養(yǎng)殖提供支撐材料，同時也為其他經(jīng)濟魚類的抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

試驗用雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚均來自江蘇省陽澄湖養(yǎng)殖基地，雌核發(fā)育草魚與普通草魚各3組，每組選取體質健康，規(guī)格整齊的草魚6尾。

1.2試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

活體解剖取出頭腎和脾臟等組織，在用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理水配制的磷酸緩沖液（PH 7.4）中漂洗，經(jīng)過液氮冷凍后，放于-80 0C保存，用于總RNA的提取。血液的采集通過已加入滅菌抗凝劑的注射器從尾靜脈抽取，于4 0C 10 000 r/min離心10 min后收集血細胞，經(jīng)過液氮冷凍后，放于-80 0C保存。

用RNAiso Plus （Takara）提取各組織的總RNA，用DNA酶（Dnase I Rnase Free，Takara）消化后，溶于20 μL RNase-free的水中，經(jīng)紫外分光光度計檢測RNA的濃度、1010的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性后，取3μg總RNA按照Prime-ScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）說明書合成cDNA第一鏈，-20 0C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計

根據(jù)NCBI上已收錄的草魚免疫球蛋白基因IgD（ GQ429174.1）、IgZ（ GQ201421.1）和IgM（DQ-417927.1），用Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物，如表1所示。

1.2.3 Real-time熒光定量PCR分析

將各組織和血液的cDNA模板進行梯度稀釋，用草魚免疫球蛋白基因引物和β-actin引物，以SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa， Dalian， China）試劑盒提供的試劑在Bio-Rad CFX96 Real-timePCR System上進行定量PCR。反應體系如下：SYBR Premix Ex Taq'nvi 10μL，熒光定量PCR引物（2μLmol/L）各1.6μL，cDNA模板2μL，滅菌蒸餾水4.8μL。反應程序為95 °C 10 s；95 °C 5 s.60 °C 30 s，40個循環(huán)；每次反應都通過從95 °C降至60 °C（每10 s降0.5℃）繪出溶解曲線。每次反應都以無菌水作為空白對照。

結果計算采用LIVAK等[8]的2-A△Ct方法進行，目的基因mRNA的表達量經(jīng)與盧-actin，比較后，再與對照樣品進行相對定量。所得數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（x±sx）表示，用GraphPad 5.0繪制草魚免疫球蛋白各基因相對表達量直方圖。

1.2.4血清溶茵酶活性差異

1.2.4.1血清的制備

分別對雌核發(fā)育抗病草魚和普通草魚進行尾靜脈采血，4 0C 3 500 r/min離心15 min，收集血清保存于-80 0C待測。

1 .2.4.2血清溶菌酶活性的測定

采用溶菌酶檢測試劑盒（南京建成科技公司）進行溶菌酶活性的測定。將配好的應用菌液、標準品液及所需檢測的樣本均放人37 °C水浴箱中預溫5 min以上，使菌液、標準液及檢測樣本的溫度達37℃。在波長530 nm處，1 cm光徑比色皿，以雙蒸水調透光度100010后，往相應編號的試管中加入200 μL待測樣本或標準品，取2 mL應用菌液迅速沖入試管中，立即混勻，開始計時。之后將其迅速倒人比色皿中，在530 nm處比色，在Ss和2 min 5 s時分別讀取透光值。按下式計算溶菌酶含量：

溶菌酶含量（mig/L）=（測定透光度一測定透光度）/（標準透光度一標準透光度）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.5 血清中免疫生化指標的測定

分別對雌核發(fā)育抗病草魚、普通草魚進行尾靜脈采血，4 0C 3 500 r/min離心15 min，收集血清，于美國雅培C一8000全自動生化分析儀上進行白蛋白、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和肌酐的測定。

2 結果與分析

2.1 雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚組織血液中免疫球蛋白基因的表達差異

實時熒光定量RT-PCR結果表明，雌核發(fā)育抗病草魚血液和脾臟中免疫球蛋白IgZ轉錄本豐度明顯高于普通草魚（P<0.05）（圖1），其中血液中IgZ mRNA的表達量約為普通草魚的2倍；頭腎中IgZ的轉錄本豐度略高于普通草魚，但差異不顯著（P>0.05）。

雌核發(fā)育抗病草魚血液中免疫球蛋白IgM轉錄本豐度明顯高于普通草魚（P<0.05），約為普通草魚的2倍；脾臟中IgM的轉錄本豐度顯著高于普通草魚（P<0.05），而兩者頭腎中IgMmRNA表達量相當，差別不大（圖2）。

雌核發(fā)育抗病草魚頭腎中免疫球蛋白IgD轉錄本豐度明顯高于普通草魚，約為普通草魚的8倍（_P<0.01）；脾臟中IgD的轉錄本豐度高于普通草魚（P<0.05），而兩者血液中IgD的mRNA表達量相當，差別不大（圖3）。

2.2雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚血清中溶菌酶活性的差異 分別對雌核發(fā)育抗病草魚和普通草魚血清中的溶菌酶含量進行了測定，結果如圖4所示。抗病草魚血清中溶菌酶含量明顯高于普通草魚，差異顯著（P<0.05）。

2.3雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚血清中免疫生化指標的差異

免疫生化參數(shù)的比較如表2所示，雌核發(fā)育抗病草魚血清中白蛋白含量約為普通草魚血清中白蛋白含量的4倍，差異極為顯著（P<0.01）；堿性磷酸酶含量約為普通草魚的9倍，差異極為顯著（P<0.01）；谷丙轉氨酶在雌核發(fā)育抗病草魚血清中的含量顯著高于普通草魚，差異極為顯著（P<0.01）。谷草轉氨酶在雌核發(fā)育抗病草魚血清中的含量略高于普通草魚，但差異不顯著（P>0.05）；而血清中肌酐的含量兩者差異不大。

3討論

3.1雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚組織與血液中免疫球蛋白基因的表達差異

免疫球蛋白（Ig）是脊椎動物在對抗抗原刺激的免疫應答中，由B淋巴細胞產生的一類特異性識別并中和相應抗原的具有免疫功能的球蛋白[9J。不同類別的Ig都含有4條對稱的多肽鏈構成的“Y”字型結構的基本單位[1O，11]。本研究以實時熒光定量RT-PCR技術對抗病草魚和普通草魚在IgM、IgD和IgZ mRNA的相對表達量上進行了比較研究。結果發(fā)現(xiàn)，雌核發(fā)育抗病草魚在血液和脾臟中IgZ、IgM mRNA的相對表達量以及脾臟和頭腎中IgD mRNA的相對表達量與普通草魚存在顯著差異（P<0.05），上述結果證實了雌核發(fā)育抗病草魚在免疫性能上要優(yōu)于普通草魚。但是雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚在頭腎中的IgZ、IgM，血液申的IgD mRNA相對表達量上無顯著性差異。這可能與免疫球蛋白的功能差異有關。郝貴杰等[12]和呂翠等[13]研究表明，IgM由B細胞分泌，出現(xiàn)于血液和其他體液，作為免疫效應分子存在；IgZ在草魚粘膜免疫中發(fā)揮重要的作用。因此在脾臟和血液中能較為敏感地檢測到這兩種免疫球蛋白的表達差異。雌核發(fā)育抗病草魚相對于普通草魚脾臟和血液中極高的IgZ和IgM mRNA表達量，說明在效應分子及粘膜免疫方面具有極大優(yōu)勢。關于魚類IgD的功能研究較少，目前普遍接受的觀點是IgD能作為淋巴細胞膜上的特異性抗原受體[141。B淋巴細胞主要集中在頭腎和脾臟中，這為雌核發(fā)育抗病草魚脾臟和頭腎中IgD mRNA的高表達量提供了合理的解釋，進一步說明了雌核發(fā)育抗病草魚相較于普通草魚的高免疫機能。

3.2雌核發(fā)育抗病草魚血清溶菌酶活性優(yōu)于普通草魚

溶菌酶是一種能水解致病菌中粘多糖的堿性酶，是各種動物極為重要的一類非特異性免疫因子。YADA[15]和YE等[1 6]的研究指出該酶除了具有抗菌、消炎、抗病毒等作用外，還可誘導調節(jié)其他免疫因子的合成與分泌，是動物免疫環(huán)節(jié)中不可或缺的因素。隨著草魚免疫學研究的發(fā)展，溶菌酶在草魚免疫系統(tǒng)中的作用越來越清晰。武煥陽等[17]的研究表明草魚的溶菌酶是草魚抵抗病原菌感染的重要非特異性因子之一。Rombout等[18]和關建義等[19]認為，在水產動物血清中，溶菌酶活性的高低是衡量機體免疫狀態(tài)的重要指標，同時又是衡量養(yǎng)殖環(huán)境污染程度的重要指標。因此，草魚血清溶菌酶活性的測定能較為準確地反應出草魚抗病性的強弱。本研究結果表明，雌核發(fā)育抗病草魚血清中溶菌酶活性明顯高于普通草魚（P<0.05），說明雌核發(fā)育抗病草魚比普通草魚能更有效地抵御細菌感染，從而進一步說明了與普通草魚相比，雌核發(fā)育抗病草魚具有更好的免疫機能。

3.3從生化指標角度顯示的雌核發(fā)育抗病草魚抗病力的優(yōu)越性

草魚的血清生化指標不僅與生活環(huán)境和營養(yǎng)有關，還與性別和健康狀態(tài)有關。馮建等[20]的研究指出，依據(jù)血液指標的變化所指示的生物機體的功能變化，不僅可以診斷魚病和檢測飼養(yǎng)環(huán)境，還可以在遺傳育種方面提供重要支持。谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、白蛋白和肌酐均是機體抵御病害及反映器官機能的重要免疫因子。本研究通過對雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚血清中這5種免疫因子的測定比較來探究兩者抗病性的差異。實驗結果顯示，雌核發(fā)育抗病草魚血清中白蛋白、堿性磷酸酶和谷丙轉氨酶的含量均顯著高于普通草魚，差異極為顯著（P<0.01）。谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶均與肝臟等器官的功能有關，其數(shù)值增加能直觀地反應出機體的健康狀態(tài)和抵抗疾病的能力。雌核發(fā)育抗病草魚血清中谷丙轉氨酶含量增加，說明氨基酸的轉換作用增強，聯(lián)合脫氨作用更容易進行，即魚體內氨基酸的氧化代謝強度較大。但增加后的谷丙轉氨酶數(shù)值是否已達到了肝臟損傷的臨界值，尚需作進一步的研究。ZHU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，活動量多的魚，體內白蛋白增加。雌核發(fā)育抗病草魚血清中白蛋白含量是普通草魚的4倍，提示抗病草魚的生命活力較為旺盛，體質健康。肌酐是肌肉的代謝產物，檢測血液中肌酐是了解腎功能的主要方法之一，腎功能衰退，則肌酐含量增加。本研究顯示雌核發(fā)育抗病草魚與普通草魚血清中肌酐含量雖然沒有顯著差異，但雌核發(fā)育抗病草魚略低于普通草魚，～定程度上反映了其腎臟良好的功能。本研究結果充分顯示了雌核發(fā)育抗病草魚在血清免疫生化因子方面較普通草魚的明顯優(yōu)勢。

以上研究結果顯示，雌核發(fā)育抗病草魚在免疫機能上優(yōu)于普通草魚。本研究結果為魚類抗病育種成果評價建立全面、準確、權威的評估體系提供了參考。