曹青鋒 閆舒雅 龍佳寶 孟祥賢

摘 要：DNA邏輯門在分子計(jì)算機(jī)和分子水平上的計(jì)算技術(shù)中具有重要作用。我們通過(guò)設(shè)計(jì)核酸適體與凝血酶特異結(jié)合導(dǎo)致膠體金團(tuán)聚的方法，構(gòu)建了凝血酶的DNA邏輯門。凝血酶作為輸入信號(hào)與其核酸適體結(jié)合，將監(jiān)測(cè)探針上的膠體金結(jié)合位點(diǎn)釋放，兩個(gè)核酸功能化修飾的膠體金同時(shí)結(jié)合到監(jiān)測(cè)探針上，引起膠體金團(tuán)聚，實(shí)現(xiàn)信號(hào)輸出。根據(jù)這個(gè)設(shè)計(jì)原理，成功構(gòu)建了蛋白質(zhì)凝血酶的YES邏輯門。關(guān)鍵詞：DNA邏輯門；凝血酶：膠體金：核酸適體

中圖分類號(hào)：Q955 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）03-0210-03

以核酸為基礎(chǔ)的分子計(jì)算機(jī)或者分子水平上的信息處理有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的以硅作為原件的計(jì)算機(jī)技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義[1-6]。這是因?yàn)楹怂崤c以硅為基礎(chǔ)的生物運(yùn)算相比具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、能和其互補(bǔ)鏈雜交，以及能與目標(biāo)分子f金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)）相互作用的特點(diǎn)，在構(gòu)建DNA計(jì)算機(jī)方面有巨大優(yōu)勢(shì)。設(shè)計(jì)并構(gòu)建DNA邏輯門引起了國(guó)內(nèi)外廣大研究者的興趣[7～13]。如：汪爾康院士利用核酸置換技術(shù)和G四聚體組裝技術(shù)構(gòu)建邏輯門，在體外模擬控制光敏劑PPIX的釋放[8]；Song等采用兩個(gè)DNA origami納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建用于microRNA檢測(cè)的邏輯門[9]；Xu等利用連接酶形成環(huán)形DNA分子構(gòu)建邏輯門[10]；Winner等構(gòu)建了一個(gè)基于離子的DNAzyme邏輯門實(shí)現(xiàn)U022+的靈敏檢測(cè)等等[11]。

在本文中，我們利用核酸適體和膠體金技術(shù)構(gòu)建了一種新型的DNA邏輯門，用于蛋白質(zhì)凝血酶分析。核酸適體是經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX（指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化）篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。它是一系列單鏈核酸分子，與特異靶分子相結(jié)合，特異性如同抗體一樣，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。核酸適體在生物傳感器、新藥開(kāi)發(fā)以及納米技術(shù)等方面有著廠一泛的用途[14]。本文選用凝血酶蛋白質(zhì)作為邏輯門的輸入，利用凝血酶與其核酸適體特異結(jié)合，釋放出監(jiān)測(cè)探針上的膠體金結(jié)合位點(diǎn)，引起膠體金團(tuán)聚，實(shí)現(xiàn)邏輯門信號(hào)輸出，實(shí)現(xiàn)凝血酶分析。

1試驗(yàn)方法

1.1試劑與儀器

試劑：本文中所用寡核苷酸由大連寶生物公司合成。Nl：CTT CTT GGC AGT CCG TGG TAGGGC AGG TGG GGG TGA CT； N2：GCC AAG AAGGGG GAC TGC CAA GAA G：N3： SH - TTTT CT-TCTTGGC。Nl是凝血酶核酸適體序列；N2是監(jiān)測(cè)探針序列；N3序列在5 7端修飾有巰基。HAu-Cl4、BSA、HSA、IgG，檸檬酸三鈉購(gòu)自上海生工生物有限公司，凝血酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司，所用其他化學(xué)試劑均為分析純。儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV 1750日本島津）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1 .2.1 膠體金的制備

該方法采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。首先將100 ml_， O.O1%的HALiCl4溶液在加熱攪拌器上攪拌加熱至沸騰，迅速加入4.5 mL l%的檸檬酸三鈉水溶液并繼續(xù)攪拌加熱。煮沸7～10min，最后定格為透明酒紅色。室溫冷卻，封存于4 °C的冰箱中。

1.2.2膠體金的核酸功能化修飾

首先將制得的金溶膠濃縮1倍，于1mL濃縮的納米金中緩慢加入N3溶液，室溫放置16 h后逐滴加入100 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4），隨后加入2 mol/L NaCl進(jìn)行老化。離心分離，最后將沉積物分散于10 mmol/L PBS中，4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紫外吸收光譜的測(cè)定

配制底液：20 mmol/L Tris-HCl （pH=7.4），2 mmol/L MgCl2。在底液中加入10 nmol/L凝血酶和100 nmol/L Nl，孵育30 min，再加入100 nmol/LN2和N3，孵育5 min后在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定。特異性實(shí)驗(yàn)過(guò)程和凝血酶實(shí)驗(yàn)過(guò)程一樣，只是用其他蛋白（BSA、HSA、IgG）代替凝血酶。以上反應(yīng)溫度為室溫。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)二進(jìn)制“1-0”概念設(shè)計(jì)的可進(jìn)行特殊運(yùn)算的邏輯門，有一個(gè)輸入便有一個(gè)輸出結(jié)果。“YES”門是當(dāng)輸人為1時(shí)輸出也為1。我們把蛋白質(zhì)凝血酶作為輸入信號(hào)，膠體金團(tuán)聚信息作為輸出信號(hào)，利用凝血酶與其核酸適體特異相互作用導(dǎo)致膠體金團(tuán)聚的原理，構(gòu)建了YES邏輯門。示意圖見(jiàn)圖1。邏輯門由鏈Nl、N2和N3組成。Nl是核酸適體序列，由兩部分組成，一部分是凝血酶的核酸適體序列，另一部分能與N2互補(bǔ)，封閉膠體金結(jié)合位點(diǎn)；N3是核酸功能化修飾的膠體金（Au-DNA）；N2是監(jiān)測(cè)探針序列，有兩個(gè)相同的Au-DNA結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)N2監(jiān)測(cè)探針上的兩個(gè)Au-DNA結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)與Au-DNA結(jié)合時(shí)，膠體金團(tuán)聚，引起膠體金吸收峰值下降，甚至吸收峰紅移；但是當(dāng)沒(méi)有凝血酶輸入時(shí)，核酸適體與監(jiān)測(cè)探針結(jié)合，封閉膠體金結(jié)合位點(diǎn)，則不能引起膠體金團(tuán)聚，沒(méi)有吸收峰值下降或吸收峰紅移現(xiàn)象，從而沒(méi)有信號(hào)輸出。

從圖1可以看出，作為邏輯門信號(hào)輸出方式的功能化膠體金對(duì)邏輯門構(gòu)建具有重要意義。我們首先檢測(cè)了核酸功能化修飾的膠體金（圖2）。我們發(fā)現(xiàn)新制備的膠體金在522 nm有一個(gè)明顯的吸收峰，但是加入鈉離子后，吸收峰發(fā)生明顯的紅移，且522 nm處吸收明顯下降（圖2A）；但是當(dāng)膠體金用核酸進(jìn)行功能化修飾后，加入鈉離子，我們發(fā)現(xiàn)吸收峰沒(méi)有明顯的偏移，同時(shí)522 nm處的吸收值沒(méi)有顯著變化。這些結(jié)果說(shuō)明膠體金進(jìn)行了很好的核酸功能化，即使加入較高濃度的鹽條件下仍然能保持良好的分散性能，能夠很好地用于邏輯門構(gòu)建。

YES門是邏輯門中最簡(jiǎn)單的門之一。當(dāng)有輸入信號(hào)時(shí)，就有輸出信號(hào)產(chǎn)生。在圖3中，發(fā)現(xiàn)輸入凝血酶，在522 nm的吸收值發(fā)生明顯下降，吸收峰明顯紅移；而沒(méi)有凝血酶時(shí)，在522 nm有一個(gè)明顯的吸收峰。這是因?yàn)槟概c核酸適體結(jié)合，將探針上膠體金結(jié)合位點(diǎn)釋放，加入核酸功能化修飾的膠體金，兩個(gè)膠體金同時(shí)結(jié)合到探針上，導(dǎo)致膠體金團(tuán)聚，輸出信號(hào)；當(dāng)沒(méi)有凝血酶輸入時(shí)，不能有效釋放膠體金結(jié)合位點(diǎn)，功能化膠體金不能同時(shí)結(jié)合到探針上，則不能輸出信號(hào)。上述結(jié)果證明我們有效地構(gòu)建了以凝血酶為輸入信號(hào)，以膠體金團(tuán)聚為輸出信號(hào)的YES邏輯門。

最后我們探索了新研制的DNA邏輯門的特異性。這是因?yàn)樽鳛榉肿佑?jì)算機(jī)基礎(chǔ)的DNA邏輯門為實(shí)現(xiàn)疾病的診治及預(yù)后，必須具有好的特異性[3-5]。我們用非凝血酶蛋白質(zhì)（BSA、HSA、IgG）對(duì)邏輯門的特異性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示在圖4中。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)輸入BSA、HSA、IgG等蛋白質(zhì)時(shí)，吸收峰及吸收值都沒(méi)有明顯變化，但是當(dāng)輸入凝血酶蛋白質(zhì)時(shí)，522 nm吸收峰明顯降低，峰出現(xiàn)明顯紅移。這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明邏輯門具有好的特異性。

3討論

我們根據(jù)核酸適體和蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，引起功能化膠體金團(tuán)聚的特性，構(gòu)建了凝血酶輸入信號(hào)的YES邏輯門，快速監(jiān)測(cè)凝血酶在樣品中的存在。當(dāng)我們將凝血酶的核酸適體設(shè)計(jì)為其他蛋白質(zhì)或小分子的核酸適體時(shí)，依據(jù)該邏輯門構(gòu)建方法，我們可以構(gòu)建其他蛋白質(zhì)或小分子的邏輯門，從而實(shí)現(xiàn)更多蛋白質(zhì)等物質(zhì)的監(jiān)測(cè)，在臨床上為疾病的防治將有重要的作用。