趙芹等

摘 要 根據(jù)LINE逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增黑皮冬瓜“B98K”基因組DNA，獲得580 bp左右目的條帶。將PCR產(chǎn)物回收、克隆并測(cè)序，獲得23條逆轉(zhuǎn)酶序列，利用生物信息學(xué)軟件分析其長(zhǎng)度變異、堿基變化、相似性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：這些序列長(zhǎng)度在557～593 bp區(qū)間變異，同源比對(duì)核苷酸序列相似性為39.0%～99.3%，存在高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為缺失突變、移碼突變與終止密碼子突變，核苷酸序列聚類分析分為4個(gè)家族，家族1與家族2分別包含15和5個(gè)成員，占總序列數(shù)的65.22%和21.74%。對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，第12位氨基酸殘基處存在一保守的苯丙氨酸（Phe），多處位置存在半保守氨基酸殘基；氨基酸序列相似性在20.0%～99.5%之間；其中8條序列可能具有轉(zhuǎn)錄活性，8條與15條序列分別發(fā)生移碼與終止密碼子突變。與已知物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列較保守，且與擬南芥、李、油菜等有較近的親緣關(guān)系。研究結(jié)果為后續(xù)利用分子標(biāo)記研究冬瓜種質(zhì)遺傳變異及基因組進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 黑皮冬瓜；LINE逆轉(zhuǎn)座子；逆轉(zhuǎn)錄酶；序列分析

中圖分類號(hào) S642.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Degenerate primers were designed according to the RT conserved motifs of LINE retrotransposons to amplify genomic DNA of black wax gourd“B98K”for investigating and understanding genetic relationship， characteristics and evolution of LINE retrotransposon families from black wax gourd. The PCR products of 580 bp were obtained and cloned to pMD18-T vector， and the positive clones were screened and sequenced. The full-length variation， base composition， homology and phylogenetic relationship of twenty-three different sequences were analyzed by bio-informatics softwares. The results indicated that length of RT sequences concentrated on the region of 557-593 bp， and sequence similarities varied from 39.0%-99.3%. These sequences showed high heterogeneity which was mainly characterized by deletion， frameshift and termination codon mutation. Four families were divided by alignment analyses of nucleotide sequences， and family1 and family2 contained most members of black wax gourd LINE retrotransposons and accounted for 65.22% and 21.74%， respectively. The analysis results of deduced amino acid sequences showed that there is a conservative phenylalanine（phe）in the 12th amino acid residue position of the translated sequences and lots of semi-conservative points appeared in many positions. Eight sequences were found to have transcriptional activity， moreover eight and fifteen sequences presented termination codon and frameshift mutations respectively， and amino acid sequence similarities ranged from 20.0% to 99.5%. The phylogenic tree constructed by these sequences and other RT sequences from GenBank showed that RT sequences of LINE retrotransposons in black wax gourd were conservative， and shared high homology with other species like Arabidopsis， plum and rape， etc. This work offers the basis for developing molecular markers to analyze the genetic variability and research the origin and evolution pathways of black wax gourd.

Key words Black wax gourd； LINE retrotransposons； Reverse transcriptase； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.004

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）為冬瓜屬一年生蔓性植物，原產(chǎn)中國(guó)與印度，現(xiàn)廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在中國(guó)種植歷史悠久，南北地區(qū)分布廣泛[1]。冬瓜易栽培，產(chǎn)量高，耐貯運(yùn)，保健藥用價(jià)值高[2-3]，是華南地區(qū)北運(yùn)和出口創(chuàng)匯的重要蔬菜品種，對(duì)調(diào)節(jié)蔬菜淡季、保證蔬菜周年供應(yīng)起著非常重要的作用[4]。冬瓜種質(zhì)資源豐富，但目前對(duì)其種質(zhì)資源分類評(píng)價(jià)研究較少，前人主要依據(jù)生態(tài)學(xué)性狀或RAPD與ISSR標(biāo)記開展此類分析[5-7]，而不同種形成與進(jìn)化之間的關(guān)系尚不清楚。源于植物逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面[8-10]，為開展冬瓜種質(zhì)研究提供了新的視野。此外，冬瓜花色、花型與瓜型及抗性性狀差異很大，但對(duì)這些性狀的形成機(jī)制尚不明確。據(jù)報(bào)道逆轉(zhuǎn)座子易受外界因素激活轉(zhuǎn)座導(dǎo)致基因突變、基因組擴(kuò)增及重排等，造成植物遺傳變異[11-14]，在葡萄果皮顏色[15]和菜豆花色形成[16]等方面發(fā)揮重要作用，因此明確逆轉(zhuǎn)座子與冬瓜生物學(xué)性狀及遺傳進(jìn)化間關(guān)系具有重要意義。

根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)特征，逆轉(zhuǎn)座子可分為長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Long terminal repeat，LTR）和非長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Non-long terminal repeat，non-LTR）兩類。它以RNA為中間產(chǎn)物在寄主基因組內(nèi)不斷轉(zhuǎn)座增殖，影響寄主基因組的大小、結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化等[17]，大部分逆轉(zhuǎn)座子在生物及非生物因素脅迫下可被激活[18]，其序列的克隆與分析對(duì)解析植物基因組組成、進(jìn)化及表達(dá)調(diào)控具有重要意義[19-21]。non-LTR類逆轉(zhuǎn)座子已在多種植物中進(jìn)行研究，且開發(fā)出不同的分子標(biāo)記技術(shù)[20，22-24]。目前尚未見冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列分離及進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄活性研究的報(bào)道。因此，本研究擬克隆冬瓜LINE類逆轉(zhuǎn)座子RT片段，利用生物信息學(xué)軟件分析其變化特點(diǎn)及與其他物種序列的相似性，以期為冬瓜基因組起源與遺傳進(jìn)化、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為黑皮冬瓜“B98K”由廣東省農(nóng)科院蔬菜所瓜類研究一室保存；冬瓜種子播種至溫室營(yíng)養(yǎng)盤內(nèi)，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄酶序列PCR擴(kuò)增 采用改良CTAB法提取冬瓜基因組總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及納米紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度。

參照Hill等[22]設(shè)計(jì)擴(kuò)增LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列的引物。引物序列為L(zhǎng)INE-F： 5′-GGG ATCCNG

GNCCNGAYGGNWT-3′；LINE-R： 5′-SWNARNGG

RTCNCCYTG-3′，其中R=A/G，Y=C/T，S=C/G，W=A/T，N=A/C/G/T。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括DNA 100 ng，10×Ex buffer（含MgCl2）2.5 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，1 U Ex Taq DNA聚合酶，引物終濃度為1.0 μmol/L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。

1.2.2 PCR產(chǎn)物克隆及序列測(cè)定 回收純化PCR產(chǎn)物，與pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，Amp抗生素篩選，挑取白斑利用M13通用引物菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送與廣州英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列分析 測(cè)序序列利用NCBI vecscreen程序去除載體部分，利用NCBI Blastx推導(dǎo)比對(duì)獲得RT基因片段及推導(dǎo)的氨基酸序列，應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)RT序列長(zhǎng)度、堿基組成、G+C含量、氨基酸序列、多重比對(duì)等進(jìn)行分析，結(jié)合GenBank報(bào)道的其他物種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜LINE類逆轉(zhuǎn)座子RT序列的擴(kuò)增與序列測(cè)定

利用簡(jiǎn)并引物在黑皮冬瓜“B98K”中檢測(cè)到約580 bp長(zhǎng)度的特異片段（圖1），預(yù)期大小與其他植物L(fēng)INE逆轉(zhuǎn)座子RT序列基本一致[25]，說(shuō)明該類逆轉(zhuǎn)座子在冬瓜中普遍存在。

將PCR產(chǎn)物回收克隆，隨機(jī)挑取24個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序。經(jīng)NCBI blastx程序同源搜索發(fā)現(xiàn)，23條序列與其它物種non-LTR逆轉(zhuǎn)座子RT序列具有較高同源性，除BhRT17外，其他序列均含有RT保守域，說(shuō)明本研究克隆到了冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列，依次命名為BhRT1～BhRT23（表1）。

2.2 冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列同源性分析

DNAStar軟件分析表明，23條RT序列長(zhǎng)度并不完全一致，變化范圍為557～593 bp，BhRT12最長(zhǎng)，BhRT21最短，其余序列長(zhǎng)度在570～583 bp之間（表1與圖2）；堿基分析發(fā)現(xiàn)，所有序列富含堿基AT，A、T、C、G數(shù)目變化范圍分別為110～198、159～217、117～171和81～111，AT與GC比例為1.26～1.46。由表2可以看出，冬瓜RT序列間相似性在39.0%～99.3%之間，其中BhRT16與BhRT3相似性最高為99.3%，BhRT17與BhRT22相似性最低為39.0%（表2）。由此可見，同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增所得的逆轉(zhuǎn)座子RT序列并不一致，在序列長(zhǎng)度、堿基變化及序列相似性等方面存在較大差異，表明同一種質(zhì)內(nèi)同一類群逆轉(zhuǎn)座子存在高度異質(zhì)性，甜菜、牡丹等作物也表現(xiàn)類似特點(diǎn)[25-27]。

2.3 冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列聚類分析

分析23條RT序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）發(fā)現(xiàn)，RT序列根據(jù)遺傳距離分成4個(gè)家族（family 1～4），每組代表由同一祖先而來(lái)或親緣關(guān)系較近的遺傳家系。其中family 4僅包含一個(gè)序列BhRT12，為長(zhǎng)度最長(zhǎng)的一個(gè)序列（593 bp），與其它家族的遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)列為一族，可能是由于核苷酸序列間的缺失突變?cè)斐傻?；family 1～3分別包括15個(gè)、5個(gè)和2個(gè)序列，family 1與family 2分別占克隆總數(shù)的65.22%與21.74%，說(shuō)明這2個(gè)家族是克隆獲得冬瓜逆轉(zhuǎn)座子RT序列的主要成分；family 1包含的15條RT序列相似性在72.3%～ 99.3%之間，核苷酸序列長(zhǎng)度除BhRT8與BhRT21差異比較大外，其余序列表現(xiàn)比較一致，也表現(xiàn)出一定的差異性，主要是由不同程度的點(diǎn)突變、堿基替換及缺失突變?cè)斐傻?；family 1可分為3個(gè)亞家族，分別包含9個(gè)、3個(gè)與3個(gè)RT序列，亞家族相似性分別在71.3%～99.3%、64.3%～78.5%與87.0%～99.0%之間，其中BhRT16與BhRT7相似性達(dá)99.3%，這可能在進(jìn)化過(guò)程中是由一類逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生突變等造成的。family 2分為2個(gè)亞家族，分別含有BhRT23、BhRT11與BhRT1以及BhRT18與BhRT22，序列相似性在88.3%～96.4%與96.6%，同樣表現(xiàn)缺失突變、堿基替換與點(diǎn)突變。family 3的BhRT3與BhRT20 RT序列相似性為67.9%。由此可見，堿基替換、點(diǎn)突變或缺失突變都可能是同一家族逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生多拷貝群的原因。同時(shí)在不同家族包含克隆數(shù)的差異，反映了各家族轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過(guò)程的差異。

2.4 冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列分析

將各RT序列通過(guò)NCBI Blastp程序同源搜索，發(fā)現(xiàn)與其他物種逆轉(zhuǎn)錄酶具有較高相似性，據(jù)此將23條序列推導(dǎo)翻譯成氨基酸序列，其中BhRT3、BhRT17與BhRT20從第2個(gè)核苷酸起始翻譯，其它序列從第3個(gè)核苷酸起始；進(jìn)一步分析表明，第12位氨基酸殘基處存在一保守苯丙氨酸（Phe），推測(cè)此位點(diǎn)可能是LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列中非常保守的位點(diǎn)，另外多處位置存在半保守氨基酸殘基（圖3）；有8條序列（BhRT6、BhRT8、BhRT9、BhRT10、BhRT12、BhRT13、BhRT19與BhRT21）發(fā)生移碼突變；15條序列發(fā)生不同程度終止密碼子突變，其中8條序列存在3個(gè)終止密碼子突變，3條序列存在2個(gè)終止密碼子突變，4條序列存在1個(gè)終止密碼子突變；另外，8條序列存在轉(zhuǎn)錄活性（BhRT1、BhRT5、BhRT11、BhRT14、BhRT16、BhRT18、BhRT20與BhRT22），占34.78%，所以移框突變和終止密碼子突變可能是逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生突變與不能表達(dá)，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的重要原因（圖4）。

經(jīng)DNAStar軟件Clustal W同源比對(duì)，23條RT氨基酸序列相似性為20.0%～99.5%（表2），BhRT23與BhRT17相似性最低，BhRT19與BhRT9及BhRT16與BhRT5相似性最高。核苷酸序列相似性最低的BhRT13與BhRT18（40.2%），其氨基酸序列相似性并非最低（25.9%），這主要是由于密碼子的簡(jiǎn)并性造成的，也充分說(shuō)明同一來(lái)源的逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性較高。對(duì)各家族氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，family 1中15條RT序列的氨基酸序列相似性為36.6%～99.5%；famlily 2中5條RT序列相似性為41.1%～95.8%；family 3中2條序列相似性為95.9%；各家族所包含的克隆數(shù)越多，序列相似性越高，發(fā)生轉(zhuǎn)座時(shí)間越近，具有轉(zhuǎn)座活性的可能性亦越大。family1～family3包含全部具有轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子，氨基酸序列翻譯也證實(shí)了該結(jié)論。

2.5 冬瓜LINE類逆轉(zhuǎn)座子RT序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

結(jié)合GenBank的13份物種RT序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果分析表明，來(lái)源冬瓜的23條RT序列比較復(fù)雜，與李、擬南芥、油菜、可可、甜菜、甜橙、黃瓜等有較高相似性；它們?cè)诰垲悎D中主要分為5組，18條冬瓜RT序列與黃瓜（Cucumis sativus，XP_004172985）、葡萄（Vitis vinifera，CAN66430）、甜橙（Citrus sinensis，XP_006490008）、濕地松（Pinus elliottii，CAA12932）、水稻（Oryza sativa，EEC80620）等12份植物序列相似性較高，劃分在第1組，第1組約占冬瓜克隆RT序列總數(shù)的78.26%，表明冬瓜逆轉(zhuǎn)座子RT序列具一定保守性；冬瓜RT序列BhRT21單獨(dú)形成第2組；第3組包括3條冬瓜RT序列BhRT9、BhRT19與BhRT8；冬瓜序列BhRT2單獨(dú)形成第4組，與其它組遺傳距離較遠(yuǎn)；而可可（Theobroma cacao，XP_007008704）與其他植物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，單獨(dú)為一分支，為第5組，這4條冬瓜RT序列單獨(dú)列為4組，說(shuō)明冬瓜逆轉(zhuǎn)座子RT序列具有較高異質(zhì)性與遺傳變異率。逆轉(zhuǎn)座子在植物界廣泛分布，作為基因組的組成成分之一，在世代間不僅可以縱向傳遞，還可以橫向傳遞。上述分析表明不同物種中存在著起源相同或相近的逆轉(zhuǎn)座子，不同種屬間有時(shí)存在比種屬內(nèi)相似性更高的逆轉(zhuǎn)座子。由此可見，在冬瓜進(jìn)化史中與上述物種的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列間可能存在橫向傳遞現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

冬瓜在中國(guó)栽培廣泛，類型品種豐富，對(duì)種質(zhì)資源的鑒評(píng)及系統(tǒng)進(jìn)化研究是加速品種改良和雜種優(yōu)勢(shì)利用的前提。不同分子標(biāo)記方法開展種質(zhì)遺傳多樣性研究，各有其特異性與優(yōu)勢(shì)弊端[5-7]。利用逆轉(zhuǎn)座子RT序列開發(fā)分子標(biāo)記的方法為冬瓜遺傳多樣性分析提供了新的視野。本研究利用LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列簡(jiǎn)并引物，首次從黑皮冬瓜種質(zhì)中擴(kuò)增得到目的片段，說(shuō)明LINE逆轉(zhuǎn)座子在冬瓜中廣泛存在，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是植物基因組的重要組成部分，對(duì)基因功能與基因組結(jié)構(gòu)有重要影響[28-29]，其序列的克隆和分析對(duì)植物基因組學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)具有重要研究意義。由于逆轉(zhuǎn)座子自身轉(zhuǎn)錄增殖的堿基錯(cuò)配率高，及長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中的同源序列重組與生物體防御的互作關(guān)系，形成了其高度異質(zhì)性群體[30]。本研究擴(kuò)增得到冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列長(zhǎng)度差為36 bp，小于牡丹的46 bp，在堿基序列與GC含量方面差異也較大，表現(xiàn)很高的異質(zhì)性。推斷冬瓜RT序列中存在的不同程度缺失突變、終止密碼子突變與移碼突變，可能是造成冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的主要原因，這與牡丹、甜菜等作物研究結(jié)果一致[25-26]。冬瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列存在許多保守與半保守的氨基酸位點(diǎn)，而其他多處的氨基酸位點(diǎn)表現(xiàn)很大的差異性，這可能為進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生氨基酸突變而形成的。這些都表明冬瓜基因組內(nèi)LINE逆轉(zhuǎn)座子是一類較古老元件，其異質(zhì)性是后來(lái)伴隨寄主基因組的進(jìn)化，在轉(zhuǎn)座與世代傳遞過(guò)程中逐漸積累突變的。

正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，植物體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)座子通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在受到生物和非生物脅迫后，轉(zhuǎn)錄活性將被激活[31-35]。多數(shù)冬瓜RT序列存在堿基缺失與終止密碼子突變，無(wú)終止密碼子的8條序列可能具有轉(zhuǎn)錄活性，因此推測(cè)外部因素激活了冬瓜逆轉(zhuǎn)座子，發(fā)生轉(zhuǎn)座事件，插入位點(diǎn)發(fā)生突變的逆轉(zhuǎn)座子，以無(wú)活性形式存在于基因組中，而活性轉(zhuǎn)座子可能在其它脅迫下發(fā)生遺傳學(xué)效應(yīng)。因此在各脅迫條件下處理冬瓜材料研究逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性，進(jìn)一步發(fā)掘冬瓜各性狀變異與逆轉(zhuǎn)座子的關(guān)系，將對(duì)基因組組成進(jìn)化及優(yōu)良基因發(fā)掘具有重要意義。

逆轉(zhuǎn)座子不僅可進(jìn)行世代縱向傳遞，還可進(jìn)行物種間橫向傳遞，藉此推測(cè)逆轉(zhuǎn)座子的起源、物種的形成及其與物種間的相互關(guān)系[36-37]。前人研究表明同一植物內(nèi)的同一類型逆轉(zhuǎn)座子序列變異較大，而同一植物類型的逆轉(zhuǎn)座子保守性較強(qiáng)，有時(shí)種內(nèi)異質(zhì)性差異大于種屬間[38]。在隨機(jī)克隆的23條冬瓜RT序列中，BhRT22與BhRT17一致性只有39.0%，有的甚至與葡萄、擬南芥、濕地松等具有更高相似性，例如BhRT1與李（Prunus persica，XP_

007212886）一致性高達(dá)58%，說(shuō)明這些物種的LINE逆轉(zhuǎn)座子也表現(xiàn)上述特點(diǎn)，可能是不同物種間逆轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明了生物界有共同的起源。這為研究冬瓜系統(tǒng)進(jìn)化提供了依據(jù)。逆轉(zhuǎn)座子散布在基因組中成為進(jìn)化的種子，與植物進(jìn)化關(guān)系密切[37]。冬瓜23條RT序列經(jīng)系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果將其分為4個(gè)家族，不同家族里含有的RT序列數(shù)量不同，反映了不同家族逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄過(guò)程存在差異，其存在的歷史地位也可能不同，包含克隆數(shù)愈多的家族歷史愈久遠(yuǎn)，對(duì)冬瓜基因組進(jìn)化作用也可能各異。

本研究首次從黑皮冬瓜中成功克隆了LINE逆轉(zhuǎn)座子RT基因序列，為后續(xù)轉(zhuǎn)錄活性研究及開發(fā)分子標(biāo)記鑒評(píng)冬瓜種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所. 中國(guó)蔬菜品種志[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社， 2001.

[2] 尹晴紅， 董敏玉. 冬瓜功能食品對(duì)腎系疾患的治療保健作用[J]. 南京農(nóng)專學(xué)報(bào)， 2000， 16（4）： 40.

[3] Diez M J， Pico B， Nuez F. Cucurbit genetic resources in Europe[C]. Ad hoc meeting， Adana， Turkey. 2002.

[4] 謝大森， 何曉明， 赫新洲， 等. 冬瓜主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢(shì)初步分析[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2003， 19（2）： 35-37.

[5] Pandey S， Kumar S， Mishra U， et al. Genetic diversity in Indian ash gourd accessions as revealed by quantitative traits and RAPD markers[J]. Scientia Horticulturae， 2008， 118： 80-86.

[6] 張建軍， 劉世貴， 余愚群， 等. 100份中國(guó)冬瓜種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀與遺傳多樣性研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009， 46（6）： 1 855-1 861.

[7] 宋世威， 李 珍， 劉厚誠(chéng)， 等. 冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 中國(guó)蔬菜， 2010， 22： 47-53.

[8] Ruiz C， Asins M J. Comparison between Poncirus and Citrus genetic linkage maps[J]. Theoretical and Applied Genetics.， 2003， 106： 826-836.

[9] Antonius-Klemola K， Kalendar R， Schulman A H. TRIM retrotransposons occur in apple and are polymorphic between varieties but not sports[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2002， 112： 999-1 008.

[10] Venturi S， Dondini L， Donini P， et al. Retrotransposon characterisation and fingerprinting of apple clones by SSAP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2005， 112： 440-444.

[11] Mcclintock B. The significance of responses of the genome to challenge[J]. Science， 1984， 226： 792-801.

[12] Grandbastien M A， Lueas H， Morel J B， et al. The expression of the tobacco Tntl retrotransposon is linked to plant defense responses[J]. Genetica，1997， l00（1-3）： 241-252.

[13] Mhiri C， De Wilt P J， Grandbastien M A. Activation of the promoter of the Tntl retrotransposon in tomato after inoculation with the fungi pathogen clados poriumfiilvum molecular[J]. Plant-Microbe Interactions， 1999， 12（7）： 592-603.

[14] Beguiristain T， Grandbastien M A， Puigdomeneeh P， et al. Three Tntl sub-families show different stress associated patterns of expression in tobacco； consequences for retrotransposon， control and evolution in plants[J]. Plant Physiology， 2001， 127（1）： 212-221.

[15] Carrier G， Le Cunff L， Dereeper A， et al. Transposable elements are a major cause of somatic polymorphism in Vitis vinifera L[J]. PloS One， 2012， 7（3）： e32973.

[16] Erdmann P M， Lee R K， Bassett M J， et al. A molecular marker tightly linked to P， a gene required for flower and seedcoat color in common bean（Phaseolus vulgaris L.）， contains the Ty3-gypsy retrotransposon Tpv3g[J]. Genome， 2002， 45（4）： 728-736.

[17] FlavellA J， Smith D， KumarA. Extreme heterogeneity of Ty1-copia group retrotransposons in plants[J]. Molecular and General Genetics， 1992， 231： 233-242.

[18] Mhiri C， De Wit P J G M and Grandbastien M A. Activation of the promoter of the Tnt1 retrotransposon in tomato after inoculation with the fungal pathogen Clodosporium. fulvum[J]. Molecular Plant Mcrobe Interactions， 1999， 12（7）： 592-603.

[19] Biswas M K， Baig M N R， Cheng Yun-jiang， et al. Retrotransposon based genetic similarity within the genus Citrus and its relatives[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2010， 57： 963-972.

[20] Kalendar R， Flavell A J， Ellis T H N， et al. Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers[J]. Heredity， 2010， 106： 520-530.

[21] Ma Yue， He Ping， Sun Hai-yue， et al. Isolation and characterization of transcriptionally active Ty1-copia retrotransposons in Fragaria × ananassa[J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9（3）： 337-345.

[22] Hill P， Burford D， Martin D M， et al. Retrotransposon populations of Vicia species with varying genome size[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2005， 273（5）： 371-381.

[23] Martin S L. Nucleic acid chaperone properties of ORF1p from the non-LTR retrotransposon， LINE-1[J]. RNA Biology， 2010， 7（6）： 706-711.

[24] Seibt K M， Wenke T， Wollrab C， et al. Development and application of SINE-based markers for genotyping of potato varieties[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2012， 125（1）： 185-196.

[25] 宋程威， 郭大龍， 張 曦， 等. 牡丹LINE類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT序列的克隆及分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2014， 41（1）： 157-164.

[26] Kubis S E， Heslop-Harrison J S， Desel C， et al. The genomic organization of non-LTR retrotransposons（LINEs）from three Beta species and five other angiosperms[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 36（6）： 821-831.

[27] Noma K， Ohtsubo E， Ohtsubo H. Non-LTR retrotransposons （LINEs）as ubiquitous components of plant genomes[J]. Molecular and General Genetics， 1999， 261（1）： 71-79.

[28] 孫 俊， 房經(jīng)貴， 高 兵， 等. 蘋果中Ty1-copia型逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2005， 22（3）： 193-197.

[29] Tikhonov A P， SanMiguel P J， Nakajima Y， et al. Colinearity and its exceptions in orthologous adh regions of maize and sorghum[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1999， 96（13）： 7 409-7 414.

[30] Steinhauer D A， Holland J J. Direct method for quantitation of extreme polymerase error frequencies at selected single base sites in viral RNA[J]. Journal of Virology， 1986， l57： 219-228.

[31] Kalendar R， Tanskanen J， Immonen S， et al. Genome evolution of wild barley（Hordeum spontaneum）by BARE-1 retrotransposon dynamics in response to sharp microcli-matic divergence[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2000， 97： 6 603-6 607.

[32] Ellis T H N， Poyser S J， Knox M R， et al. Polymorphism of insertion sites of Ty1-copia class retrotransposons and its use for linkage and diversity analysis in pea[J]. Molecular and General Genetics， 1998， 260： 9-19.

[33] Takeda S， Sugimoto K， Otsuki H. Transcriptional activation of the tobacco retrotransposon Tto1 by wounding and methyl jasmonate[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 36： 365-376.

[34] Pearce S R， Harrison G， Li D， et al. The Ty1-copia group retrotransposons in Vicia species： Copy number， sequence heterogeneity and chromosomal localisation[J]. Molecular and General Genetics， 1996， 250（3）： 305-315.

[35] 胡志昂， 姜國(guó)強(qiáng)， 鄧 馨， 等. 野大豆種群轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)錄因子的多樣性和分子適應(yīng)[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2007， 31（5）： 952-959.

[36] Kumar A. The evolution of plant retroviruses： moving to green pasture[J]. Trends in Plant Science， 1998， 3： 371-374.

[37] Grandbastien M. Retroelements in high Plants[J]. Trends In Genetics， 1992， 8（3）： 100-108.

[38] Voytas D F， Cummings M， Koniczny A， et al. Copia-like retrotransposon are ubiquitous among plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1992， 89（15）： 7 124-7 128.