曾寶梅，王予川，黃 棟＊＊＊，王 楠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴州省人民醫(yī)院 兒科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展和新生兒救治水平的提高，許多危重新生兒尤其是早產(chǎn)兒得以生存。作為主要救治方法中的氧療，在改善患兒低氧血癥，提高機(jī)體血氧含量的同時(shí)，因長(zhǎng)時(shí)間高濃度氧氣的吸入，造成嬰兒高氧相關(guān)性支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)的發(fā)生［1］，導(dǎo)致患兒產(chǎn)生氧依賴，臨床上出現(xiàn)反復(fù)下呼吸道感染、敗血癥、持續(xù)肺動(dòng)脈高壓及肺心病等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量。如何促進(jìn)肺泡的再發(fā)育是治療該病的關(guān)鍵，肺泡形成基因P311 是與肺泡發(fā)生相關(guān)的一種階段特異表達(dá)基因，在肺泡發(fā)育中起著重要作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，BPD 的病理改變主要為肺泡發(fā)育阻滯，肺泡體積增大，數(shù)目減少［3］。本研究通過(guò)復(fù)制BPD 動(dòng)物模型，觀察肺泡形成基因P311的mRNA 表達(dá)水平變化，探討P311 基因在改善BPD 中肺泡發(fā)育阻滯，促進(jìn)肺泡再發(fā)育的作用。

1 材料及方法

1.1 主要材料與試劑

有機(jī)玻璃氧艙、醫(yī)用氧氣、氧壓表、鈉石灰、變色硅膠、4%多聚甲醛、動(dòng)物組織RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)、引物(上海生工)、SYBR Mixture(With ROX)、八聯(lián)管、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Bio－Rod)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

普通級(jí)成年昆明小鼠30 只，購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，其中雌鼠20 只，雄鼠10 只，按雌雄比2∶1 的比例隨機(jī)合籠，次日觀察陰栓，見(jiàn)陰栓者記為妊娠0.5 d，雌鼠孕第18.5 天時(shí)行剖宮產(chǎn)，取出的胎鼠，復(fù)蘇存活后視為早產(chǎn)鼠。取64 只早產(chǎn)鼠隨機(jī)分配給近日已自行分娩的母鼠喂養(yǎng)(代乳鼠)，每只代乳鼠帶8 ～10 只早產(chǎn)鼠。早產(chǎn)鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)約6 h 后隨機(jī)分為空氣組及高氧組，空氣組和高氧組根據(jù)取肺組織的時(shí)間分為第1 天組、第3 天組、第7 天組和第14 天組，每組8 只。

1.3 方法

1.3.1 BPD 動(dòng)物模型復(fù)制 動(dòng)物模型復(fù)制按參考文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行，高氧組均置于氧艙(自制60 cm×40 cm×40 cm 密閉的有機(jī)玻璃容器，頂部一進(jìn)氣孔，直徑0.5 cm，側(cè)面有1 個(gè)等大的排氣孔，進(jìn)氣孔持續(xù)通入醫(yī)用氧氣，容器內(nèi)置有飼料、水、鈉石灰、變色硅膠以及墊料)中喂養(yǎng)，用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)氧艙內(nèi)的氧濃度＞90%，氧艙內(nèi)溫度與室內(nèi)溫度約25℃，濕度60%，CO2濃度＜0.5%。每天定時(shí)開(kāi)艙添加飼料和水，并更換小鼠墊料。每日將高氧組與空氣組的代乳鼠互換，以避免高氧組代乳鼠因氧中毒致護(hù)理能力降低?？諝饨M置于同一室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)。

1.3.2 肺組織病理學(xué)檢查 采用蘇木精－伊紅染色法，早產(chǎn)鼠分別于空氣和高氧環(huán)境中飼養(yǎng)第1、3、7 及14 天后取左肺組織4%多聚甲醛固定，蘇木精－伊紅染色后，光鏡下觀察各組肺組織的病理變化。

1.3.3 P311 基因mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real－time PCR)法，根據(jù)Genebank 提供的P311 基因序列構(gòu)建引物，同時(shí)設(shè)計(jì)GAPDH 作為內(nèi)參，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P311 基因上游引物序列:3’－ctggactgaaggaagggagaat－5’，下游引物序列為3’－ttcggttcacttccttaggca－5’。取第1、3、7 及14天兩組小鼠的右肺組織，按照動(dòng)物組織RNA 提取試劑盒的步驟，提取肺組織總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，并用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA 的純度及濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟迅速將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real－time PCR體系為(With ROX)SYBR Mixture 12.5 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、cDNA 1uL、Free－water 10.5 μL，循環(huán)條件為95℃ 10 min，95℃15 s、60℃1 min、65℃5 min;40 個(gè)循環(huán)。最后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析檢驗(yàn)和多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

空氣組反應(yīng)比較靈敏，鼻尖紅潤(rùn)，毛發(fā)光澤，呼吸均勻;高氧組隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，體重增長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)發(fā)澀、無(wú)光澤，鼻尖發(fā)紺，呼吸急促;停止吸氧后，小鼠表現(xiàn)為呼吸稍困難，鼻尖明顯發(fā)紺，煩燥，反應(yīng)差。

2.2 肺組織病理變化

肉眼觀察:空氣組肺組織呈均勻淡紅色，包膜光滑、組織彈性良好;高氧組肺組織表面有散在甚至彌漫的淤血點(diǎn)，小血管擴(kuò)張、充血。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)第1 天時(shí)，兩組肺組織均表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡數(shù)目少、腔較大，肺泡間隔較厚(見(jiàn)圖1A、B);第3 天時(shí)，兩組肺泡體積漸變小，間隔漸變薄，高氧組肺泡腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1C、D);第7 天時(shí)，空氣組肺泡體積變小，肺泡數(shù)目漸增多;高氧組部分肺泡腔增大，肺間質(zhì)增生(見(jiàn)圖1E、F);第14 天時(shí)，空氣組肺泡數(shù)目漸增多，分化良好，逐漸肺泡化。高氧組肺泡腔內(nèi)間質(zhì)增生，少數(shù)肺泡融合，肺泡數(shù)量減少，肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化(見(jiàn)圖1G、H)。

圖1 早產(chǎn)小鼠肺組織病理變化(HE，×400)Fig.1 The pathological changes of lung tissue of premature mice

2.3 P311 基因mRNA 表達(dá)

第3 天時(shí)兩組P311 基因mRNA 表達(dá)量最高，隨后下降。高氧組P311 基因mRNA 表達(dá)水平高于同一時(shí)間點(diǎn)空氣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 早產(chǎn)小鼠肺組織P311 基因mRNA 表達(dá)水平Tab.1 The P311 gene expression in the lung tissue of premature mice

3 討論

BPD 由Northway 等人首次提出，盡管氧氣對(duì)于生命而言是必須的，但超過(guò)生理限線的氧氣濃度對(duì)于器官、細(xì)胞而言都具有危害性。肺臟成為長(zhǎng)時(shí)間暴露在高氧環(huán)境下最易受損的器官［5］。研究發(fā)現(xiàn)在肺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期長(zhǎng)時(shí)間吸入氧氣會(huì)導(dǎo)致肺發(fā)育受損，在機(jī)體脫離氧氣后肺組織可自行修復(fù)，但有時(shí)易損傷的肺組織并不能完全修復(fù)，最終發(fā)展為BPD。體積大、數(shù)量少的囊泡發(fā)展為體積小、數(shù)量多的肺泡是肺發(fā)育成熟的標(biāo)志［6－7］。將小鼠置于高濃度氧氣環(huán)境中的第3 天均可出現(xiàn)肺組織形態(tài)學(xué)改變，觀察至第14 天時(shí)可見(jiàn)不同程度的肺泡發(fā)育障礙及肺泡簡(jiǎn)單化表現(xiàn)。該過(guò)程與人類BPD病理過(guò)程極其相似［8］。

P311 是肺泡發(fā)生相關(guān)階段特異表達(dá)的基因，有多種生物學(xué)功能，與本研究相關(guān)的是P31l 可導(dǎo)致細(xì)胞分化為肌纖維細(xì)胞，并增加細(xì)胞的增殖及存活率［9］，而肌纖維細(xì)胞在肺泡隔膜的形成中起著非常重要的作用。在肺組織發(fā)育的過(guò)程中，從原始肺泡到肺泡的演變，最典型的形態(tài)特征就是次級(jí)隔膜的發(fā)生和生長(zhǎng)，隔膜的形成包含隔膜在特定位點(diǎn)的發(fā)生、隔膜的延伸以及隔膜上血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的重排等一系列過(guò)程。雖然這一過(guò)程的機(jī)制還不是很清楚，但通常認(rèn)為新基底膜的生成、上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞在隔膜頂端的生長(zhǎng)以及彈性蛋白的沉積起了重要的作用［10］。在這個(gè)過(guò)程中單獨(dú)的肺泡壁可能在肺泡開(kāi)口處形成一些游離“末端”，而這種末端能以一定的角度與其他肺泡壁結(jié)合形成“彎曲”，也能在一個(gè)所謂“聯(lián)結(jié)點(diǎn)”與兩個(gè)肺泡壁結(jié)合。彈性纖維和肺泡肌成纖維細(xì)胞位于呼吸過(guò)程中收縮力所在的末端和彎曲，而不是由膠原纖維控制的聯(lián)結(jié)點(diǎn)。肺泡壁上的這些彎曲被認(rèn)為是新生次級(jí)隔膜發(fā)生及延伸的位點(diǎn)，當(dāng)機(jī)械力作用于沿彎曲分布的彈性纖維時(shí)，彈性纖維被拉離肺泡壁，啟動(dòng)新隔膜的形成［11］。次級(jí)隔膜發(fā)生、重建所必須的彈性蛋白正是由肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生的［12］。因此推測(cè)P311 可能與肺泡的形成密切相關(guān)，進(jìn)而對(duì)整個(gè)肺組織的發(fā)育具有重要作用［13］。

本研究成功構(gòu)建了BPD 動(dòng)物模型，然后通過(guò)Real－time PCR 檢測(cè)P311 基因在早產(chǎn)小鼠肺組織中的mRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，P311 基因mRNA 表達(dá)水平在早產(chǎn)后第3 天肺組織中出現(xiàn)高峰，然后下降維持低水平存在，說(shuō)明P311 基因可促進(jìn)早產(chǎn)小鼠發(fā)育不成熟的肺組織肺泡的發(fā)育，導(dǎo)致P311 在早產(chǎn)后第3 天出現(xiàn)高峰，然后維持低水平存在;同時(shí)，高氧組P311 基因mRNA 表達(dá)水平高于同一時(shí)間點(diǎn)空氣組(P ＜0.05)，考慮高氧組小鼠肺組織除本身發(fā)育不成熟以外，還因長(zhǎng)期吸入高濃度氧氣而受損，說(shuō)明P311 基因可能是影響肺損傷修復(fù)的調(diào)控因子，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞和肺成纖維間質(zhì)細(xì)胞再生和轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)肺泡分隔膜的形成，抑制肺間質(zhì)纖維化形成來(lái)影響肺的修復(fù)［14］。

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