楊 星，陳 皓，葉明付，代 鑫，夏海濱

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 西安710119）

乙肝病毒核心蛋白（Hepatitis B Virus Core Protein，HBc）是構(gòu)成乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）核心抗原（Hepatitis B Core Antigen，HB－cAg）的主要單體蛋白［1］，能夠形成二十面體對(duì)稱(chēng)病毒樣粒子（Virus－like Particles，VLPs）的結(jié)構(gòu)［2］，可被用來(lái)展示外源序列。作為免疫載體蛋白［3］，HBc可在自身表面重復(fù)且高密度地展示外源性序列，從而誘發(fā)強(qiáng)有力的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)對(duì)免疫檢測(cè)也有放大作用。使用單克隆抗體研究發(fā)現(xiàn)，位于HBc衣殼表面刺突頂端的78—82位氨基酸是它的主要免疫顯性區(qū)域（Major Immunodominant Region，MIR）。MIR為特異性抗原小肽的插入提供了極佳位點(diǎn)［4］。HBc作為抗原表位小肽的載體蛋白，形成的 HBc－VLPs［5］，在研究表位小肽疫苗的制備及應(yīng)用等方面具有巨大的應(yīng)用前景。

人表皮生長(zhǎng)因子受體突變體Ⅲ（EGFRvⅢ）首次在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，普遍存在于多種惡性腫瘤細(xì)胞表面［6－7］。EGFRvⅢ 由 EGFR 缺失2—7外顯子區(qū)域所致。EGFRvⅢ的胞外區(qū)域形成了一段含有13氨基酸的特異性小肽片段，其氨基酸序列為L(zhǎng)EEKKGNYVVTDH，該小肽被命名為PEP－3［8－9］。據(jù)報(bào)道，針對(duì) EGFRvⅢ表面特異性小肽的腫瘤疫苗已用于小鼠動(dòng)物腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)研究［10］。由于EGFRvⅢ中的PEP－3小肽僅在腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)，因此PEP－3可以作為腫瘤治療中理想的靶分子，針對(duì)PEP－3的腫瘤疫苗將在腫瘤治療中發(fā)揮重要的作用。

目前，抗原表位小肽在治療性或預(yù)防性疫苗的研究中得到廣泛應(yīng)用。為了快速檢測(cè)抗原表位小肽作為疫苗的效果，本研究通過(guò)小肽的一步連接及陽(yáng)性克隆的藍(lán)白班篩選，構(gòu)建了嵌合可呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc病毒樣粒子的原核表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步測(cè)試該載體，我們將腫瘤特異性表位小肽PEP－3插入該載體，利用藍(lán)白班篩選原理獲得HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達(dá)載體，并通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)及純化獲得HBc／PEP－3融合蛋白。呈遞抗原表位小肽的乙肝病毒核心蛋白類(lèi)病毒顆粒通用原核表達(dá)載體的構(gòu)建為研究其他表位小肽的疫苗作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí) HBc／PEP－3融合蛋白的表達(dá)與純化也為后續(xù)PEP－3小肽抗腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET－28a（＋）、大腸桿菌 E.coli DH5α、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存，限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品，pGEM－T Easy Vector，T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司。rTaq酶為T(mén)aKa－Ra公司產(chǎn)品，DNA Marker為Hybigen公司出品，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于AXYGEN公司，所有引物由華大基因公司合成。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物試劑盒、Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder、PageRuler Unstained Protein Ladder 購(gòu) 自Thermo 公 司，蛋 白 純 化 所 用 Ni－NTA His－Bind Resin為Novagen公司產(chǎn)品，鼠源Anti－His Antibody購(gòu)自天根公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶BamHⅠ及SfuⅠ單一位點(diǎn)的基因片段HBc－BS的獲得 根據(jù)Gene Bank公布的HBV基因組（GI 22203511）信息，以本實(shí)驗(yàn)室已有的HBc的基因片段作為模板，使用引物P1（AGAATTCATGGACATTGACCCGTATAA）及P2（TTCGAATATGTGAAGCTTGGATCCATTACTT CCCACCCAGGT）擴(kuò)增 HBc－BS 基因F1片段（即包含HBc基因1－225bp的片段），在F1片段的5′－端引入EcoRⅠ位點(diǎn)，3′－端引入BamHⅠ－SfuⅠ位點(diǎn)；使用引物P3（GGATCCAAGCTTCACATATTCGAATTAGTAGTCAGCTAT）及 P4（TCTCGAGTTAACACTGAGATTCCCGAGAT）擴(kuò) 增HBc基因F2片段（即包含HBc基因247－552bp的片段），在F2片段的5′－端引入BamHⅠ－SfuⅠ位點(diǎn)，3′－端引入XhoⅠ位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后，采用Overlap PCR方法，以P1及P4為引物，F(xiàn)1，F(xiàn)2為模板，擴(kuò)增獲得HBc MIR區(qū)域78—82位氨基酸缺失的HBc基因片段。此外，在缺失HBc MIR片段的區(qū)域兩側(cè)分別攜帶單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamHⅠ及SfuⅠ位點(diǎn)，將獲得的片段命名為HBc－BS，約564bp?；厥债a(chǎn)物連至pGEM－T easy載體，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)，命名為pGEM－T Easy／HBc－BS，于－20℃存儲(chǔ)備用。

1.2.2 pRGHBc－BS／Lac Zα原核表達(dá)通用載體構(gòu)建

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切原核表達(dá)載體pET－28a（＋），隨后將一段兩端攜帶BamHⅠ與XhoⅠ粘性末端的多克隆位點(diǎn)片段連入上述酶切載體中，從而導(dǎo)致載體中的BamHⅠ位點(diǎn)發(fā)生突變，所獲得的陽(yáng)性克隆稱(chēng)為pET－28a（＋）／BX。多克隆酶切位點(diǎn)片段序列為：GGATCGGTCGACGAATTCTTCGAAGGATCCACAGTGGTACCCTCGAG。

載體pGEM－T Easy／HBc－BS經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，將獲得的片段HBc－BS連入經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pET－28a（＋）／BX中，經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序確認(rèn)后，獲得的陽(yáng)性克隆命名為pRGHBc。

將兩端攜帶BamHⅠ與SfuⅠ粘性末端的Lac Zα片段連入同樣酶切的載體pRGHBc中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，37℃孵育1.5h后，全菌液與50μL 40mg／μL X－gal混勻，涂至 Kan＋抗性LB固體培養(yǎng)基平板上。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，利用藍(lán)白斑篩選，挑取藍(lán)色單菌落，對(duì)所提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆。所獲得的陽(yáng)性克隆載體可以作為一種通用的原核表達(dá)載體，可用于獲得表面呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc類(lèi)病毒顆粒，該載體命名為pRGHBc－BS／Lac Zα。

1.2.3 表面呈現(xiàn)PEP－3小肽的HBc融合蛋白表達(dá)載體pRGHBc－BS／PEP－3構(gòu)建 PEP－3基因序列共39 bp，序列為 CTGGAGGAAAAGAAAGG TAATTATGTGGTGACAGATCAC ?；蚱蜭1（GATCCCTGGAGGAAAAGAAAGGTAATTATGTGGTGACAGA TCACTT）及 L2（CGAAGTGATCTGTCACCACATAATTACCTTTCTTTTCCTCCAGG ）由華大基因公司合成，室溫退火2h后，獲得兩端帶有BamHⅠ、SfuⅠ粘性末端的PEP－3基因片段。載體pRGHBc－BS／Lac Zα經(jīng)BamHⅠ及SfuⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收pRGHBc－BS載體，并將退火所形成的PEP－3片段連入其中，所獲得的陽(yáng)性克隆命名為pRGHBc－BS／PEP－3。

1.2.4 抗原表位小肽PEP－3的 HBc融合蛋白原核表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3電轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），條件為1 500V，5.0ms。加1mL無(wú)抗性LB培養(yǎng)基后，37℃孵育2h，取20μL菌液均勻涂至Kan＋抗性LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆至5mL Kan＋抗性液體培養(yǎng)基中，225r／min，37℃搖床培養(yǎng)。至菌液OD600＝0.35時(shí)進(jìn)行異丙基β－D－1－硫代半乳糖苷（IPTG，Isopropylβ－D－1－Thiogalactopyranoside）誘導(dǎo)，IPTG 終濃度為1mmol／L。誘導(dǎo)5h后收集菌液，留樣進(jìn)行檢測(cè)。以IPTG誘導(dǎo)前菌液作為對(duì)照組。

將誘導(dǎo)后的菌液100mL，7 000r／min，4℃離心10min，棄上清培養(yǎng)基，收集離心后沉淀。首先采取非變性法處理目的蛋白，即用1×Lysis Buffer（pH＝8.0）重懸菌體，加溶菌酶至終濃度為1mg／mL，冰上靜置30min。超聲破碎2×5min后，4℃，13 200r／min離心10min，棄上清，收集沉淀。隨后用1mol／L尿素漂洗沉淀2次，洗去不溶性碎片后，13 200r／min離心10min后收集沉淀。最后采用變性的方法，8mol／L尿素重懸沉淀。超聲破碎2min，相同條件下離心后，收集上清。4℃、旋轉(zhuǎn)條件下，目的蛋白與Ni－NTA結(jié)合3h。采用梯度洗脫純化目的蛋白，咪唑終濃度分別為40、60、80、300、400、900mmol／L，在300、400mmol／L咪唑濃度范圍內(nèi)收集目的蛋白。同時(shí)采用梯度透析方法進(jìn)行蛋白透析，透析液（咪唑、磷酸緩沖液PBS）中尿素終濃度分別為6、4、1、0mol／L，4℃ 磁力攪拌器攪拌下，每個(gè)梯度透析液工作45min。最終收集蛋白，測(cè)定蛋白濃度OD280。

1.2.5 重組蛋白 HBc／PEP－3的檢測(cè) 純化樣品及透析后樣品與2×SDS Loading Buffer混勻后，95℃變性10min，冰上放置2min。隨后分別進(jìn)行SDS－PAGE和 Western Blot檢測(cè)。

HBc／PEP－3樣 品 經(jīng) 10%SDS－PAGE 進(jìn) 行 分離，電泳條件為80V，30min，當(dāng)進(jìn)入分離膠時(shí)，電泳條件改變?yōu)?00V，24min。隨后采用半干法轉(zhuǎn)至PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，條件為：13V，35 min。1%脫脂牛奶－PBST溶液，4℃封閉PVDF膜，過(guò)夜。一抗為小鼠抗His抗體（His·tag mAb 1∶800稀釋?zhuān)?，室溫下孵?h，PBST洗滌3×8 min。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000稀釋?zhuān)?，室溫下孵育二?.5h，PBST洗滌3×5min，后PBS洗滌3×4min。隨后進(jìn)行ECL顯色。實(shí)驗(yàn)中以不帶His·tag的GST蛋白為陰性對(duì)照，以帶 His·tag的Glrx3－6His蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。上述兩種對(duì)照蛋白均為本實(shí)驗(yàn)室以往表達(dá)并驗(yàn)證過(guò)的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 HBc－BS 片段基因的擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得基因片段F1及F2，其長(zhǎng)度分別為 230、300bp（見(jiàn)圖1a），然后采用 Overlap PCR法擴(kuò)增HBc－BS片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得一條558bp的特異性條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（見(jiàn)圖1b），結(jié)果表明HBc－BS全長(zhǎng)片段擴(kuò)增成功。最終測(cè)序表明，所獲得HBc基因片段中第78—82位氨基酸缺失，且HBc MIR的兩側(cè)成功引入兩個(gè)單一特異性的酶切位點(diǎn)BamHⅠ及SfuⅠ。HBc－BS的片段示意圖（見(jiàn)圖1c）。

圖1 HBc－BS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖及其結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products and structure schematic diagram of HBc－BSa.HBc－BS 的PCR結(jié)果，M：DNA marker；1：HBc－BS F1片段。2：HBc－BS F2片段。b.HBc－BS 全長(zhǎng)的PCR結(jié)果，M：DNA marker；1：HBc－BS 全長(zhǎng)。c.HBc－BS 基因片段圖。

2.2 原核表達(dá)通用載體pRGHBc－BS／Lac Zα的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)將多克隆位點(diǎn)片段連入pET－28a（＋）載體，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，載體中158 bp處的BamHⅠ位點(diǎn)成功被突變，同時(shí)EcoRⅠ、BamHⅠ、SfuⅠ、XhoⅠ單一酶切位點(diǎn)被成功引入載體，表明質(zhì)粒pET－28a（＋）／BX正確構(gòu)建。

通過(guò)EcoRⅠ、XhoⅠ位點(diǎn)將HBc－BS片段連入pET－28a（＋）／BX載體中，獲得重組質(zhì)粒pRGHBc。質(zhì)粒pRGHBc經(jīng)HBc－BS兩端的內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約560bp條帶，表明基因片段HBc－BS成功連入pET－28a（＋）／BX，確定為陽(yáng)性。質(zhì)粒pET－28a（＋）／BX作為對(duì)照，被相同的內(nèi)切酶雙切后，未得到條帶（見(jiàn)圖2a中的1、2泳道）。

圖2 pRGHBc－BS／Lac Zα酶切鑒定圖及其載體示意圖Fig.2 The enzyme digestion and structure schematic diagram of universal expression vector pRGHBc－BS／Lac Zαa.pRGHBc－BS／Lac Zα的酶切鑒定圖，M：DNA marker；1：EcoRⅠ＆XhoⅠ雙切 pRGHBc；2：EcoRⅠ＆XhoⅠ雙切pET－28a（＋）／BX；3：BamHⅠ＆XhoⅠ雙切pRGHBc－BS／Lac Zα；4：BamHⅠ＆ XhoⅠ雙切pRGHBc。b.pRGHBc－BS／Lac Zα的載體結(jié)構(gòu)圖。

通過(guò)BamHⅠ、SfuⅠ位點(diǎn)將Lac Zα片段連入pRGHBc載體中，獲得重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／Lac Zα。重組質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約800bp條帶，確定為陽(yáng)性。質(zhì)粒pRGHBc作為對(duì)照，經(jīng)相同的內(nèi)切酶雙切后，得到約200bp條帶（見(jiàn)圖2a中的3、4泳道）。電泳結(jié)果表明Lac Zα成功連入pRGHBc表達(dá)載體中，為采用一步連接法將抗原小肽連入HBc，原核表達(dá)融合蛋白奠定基礎(chǔ)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pRGHBc－BS／Lac Zα表達(dá)載體構(gòu)建成功（見(jiàn)圖2b）。

2.3 pRGHBc－BS／PEP－3載體的構(gòu)建及鑒定

PEP－3基因片段通過(guò)BamHⅠ、SfuⅠ位點(diǎn)將pRGHBc－BS／Lac Zα載體中的Lac Zα片段替代，獲得重組質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3。質(zhì)粒 pRGHBc－BS／PEP－3和pRGHBc－BS／Lac Zα經(jīng)EcoRⅠ、SfuⅠ雙切，前者得到約250bp條帶，后者得到約800bp條帶，二者結(jié)果對(duì)比得出，PEP－3片段成功替代Lac Zα片段，連入pRGHBc表達(dá)載體（見(jiàn)圖3a）。同時(shí)，以HBc基因的上游引物P1及PEP－3基因片段的下游引物L(fēng)2作為引物、重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／PEP－3作為模板，采用PCR法進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增得到230bp大小條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與理論推斷相符（見(jiàn)圖3b）。最后測(cè)序結(jié)果也證實(shí)，pep－3已成功克隆到上述表達(dá)載體中。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pRGHBc－BS／PEP－3載體構(gòu)建成功（見(jiàn)圖3c）。

圖3 pRGHBc－BS／PEP－3酶切鑒定圖及載體示意圖Fig.3 The schematic diagram and identification of expression vector pRGHBc－BS／PEP－3a.pRGHBc－BS／PEP－3的酶切鑒定圖，M：DNA marker；1：EcoRⅠ＆SfuⅠ雙切 pRGHBc－BS／PEP－3；2：EcoRⅠ＆SfuⅠ雙切pRGHBc－BS／Lac Zα。b.pRGHBc－BS／PEP－3的PCR鑒定結(jié)果，M：DNA marker；1：PCR結(jié)果；2：陰性對(duì)照。c.pRGHBc－BS／PEP－3的載體結(jié)構(gòu)圖。

2.4 HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒pRGHBc－BS／PEP－3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白 HBc／PEP－3。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，采用Ni－NTA柱對(duì)表達(dá)的HBc／PEP－3重組蛋白進(jìn)行親和純化。純化目的蛋白進(jìn)行蛋白復(fù)性后再次測(cè)定濃度，所獲得的融合蛋白濃度大約為0.6mg／mL。HBc／PEP－3融合蛋白經(jīng)純化后，經(jīng)SDS－PAGE電泳顯示所得到的蛋白分子量大小約27kDa（見(jiàn)圖4a剪頭所示），與預(yù)測(cè)的分子量相吻合。通過(guò)Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證，得到分子量約27kDa的單一條帶。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBc／PEP－3表達(dá)與純化成功，為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖4 融合蛋白HBc／PEP－3原核表達(dá)純化產(chǎn)物的SDS－PAGE分析及其Western blot鑒定Fig.4 SDS－PGAE profile and Wstern blot identification of fusion protein HBc／PEP－3expressed from prokaryotic expression vectora.融合蛋白 HBc－PEP3的SDS－PAGE分析，箭頭所指為目的蛋白；1：洗脫液1，咪唑濃度為300mmol／L；2：洗脫液；2：咪唑濃度為400mmol／L。b.Western Blot鑒定；M：蛋白 Marker；1：融合蛋白 HBc／PEP－3；2：陰性對(duì)照蛋白GST；3：陽(yáng)性對(duì)照蛋白Glrx3－6His。

3 討論

本研究成功構(gòu)建了表面呈現(xiàn)抗原小肽的HBc類(lèi)病毒顆粒的通用原核表達(dá)載體。同時(shí)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了嵌有PEP－3小肽的 HBc／PEP－3融合蛋白的原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化，并通過(guò)Western blot對(duì)所表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該通用載體的構(gòu)建提高了嵌有抗原表位小肽的HBc類(lèi)病毒顆粒的原核表達(dá)，降低了實(shí)驗(yàn)成本，可為深入研究各種小肽在腫瘤疫苗治療中的作用提供良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。以PEP－3小肽為例所獲得的HBc－PEP－3融合蛋白將在腫瘤疫苗的研發(fā)及單克隆抗體的制備中發(fā)揮作用。

近年來(lái)，以HBc作為免疫載體蛋白在腫瘤免疫治療方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。相關(guān)研究利用HBc－VLPs進(jìn)行抗原的遞呈，如 Ravin NV等人［11］利用攜帶有M2蛋白的HBc－VLPs制備流感疫苗；或者利用HBc－VLPs高效的外源序列展示效果，進(jìn)行特異性抗體的制備，如Sun Chang等人［12］在HBc－VLPs的抗原展示系統(tǒng)上，獲得了針對(duì)AFP、MGAE－1的多克隆抗體。本研究寄希望于借助HBc免疫原性高，可攜帶高拷貝數(shù)免疫抗原等特點(diǎn)［13］，將抗原表位小肽嵌合至HBc表面，獲得表面呈現(xiàn)抗原表位小肽的HBc－VLPs，制備具有高效特異免疫原性的抗原蛋白，為腫瘤免疫治療或抗體制備提供良好的抗原來(lái)源。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，來(lái)源于EGFRvⅢ特異性小肽的疫苗接種對(duì)腦部腫瘤的治療效果顯著［14］，本研究以PEP－3為例，將PEP－3基因插入HBc基因的225 bp處，使其在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)融合蛋白HBc／PEP－3。結(jié)果表明：重組基因可在大腸桿菌中表達(dá)，融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體中。融合蛋白HBc／PEP－3的表達(dá)為后續(xù)研究抗原融合蛋白在惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答［15－16］，及針對(duì)腫瘤的疫苗治療研究等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)報(bào)道HBc核心蛋白單體MIR區(qū)域插入外源抗原小肽后，仍能夠形成由240個(gè)亞基聚集而成正二十面體殼粒結(jié)構(gòu)［1］，根據(jù) HBc蛋白單體及HBV衣殼蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)模式圖分析［17］，單體結(jié)構(gòu)中蛋白C端可能游離暴露在外端，而經(jīng)包裝后，C端則會(huì)被包裹在 HBc－VLPs內(nèi)部，從而對(duì)HBc／抗原小肽融合蛋白的純化造成影響。此猜想在本試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)親和層析、Western blot試驗(yàn)均得到驗(yàn)證（結(jié)果未顯示）。關(guān)于HBc蛋白聚集成二聚體或顆粒結(jié)構(gòu)的詳細(xì)組裝過(guò)程，仍需進(jìn)一步研究。為了提高蛋白純化效率及純度，本實(shí)驗(yàn)選擇了在目的蛋白N端和C端均表達(dá)6His·tag的商業(yè)化載體pET－28a（＋），此商業(yè)化載體經(jīng)改造后用于表達(dá)嵌有抗原表位小肽的HBc融合蛋白的表達(dá)與純化。同時(shí)，分別采用非變性法（1×Lysis buffer溶解蛋白）和變性（8mol／L尿素溶解蛋白）進(jìn)行蛋白純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8mol／L尿素處理蛋白后，對(duì)親和鎳柱的結(jié)合效率明顯高于非變性法處理效果。其次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)（全菌液蛋白直接進(jìn)行純化）結(jié)果相較，大腸桿菌自身表達(dá)的蛋白大部分溶解在1×Lysis buffer中，沉淀中雜蛋白含量較少，多數(shù)為目的蛋白。因此為了減少其他雜蛋白在純化過(guò)程中的非特異性結(jié)合，本實(shí)驗(yàn)采取提取包涵體的方法進(jìn)行目的融合蛋白的純化。

4 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了表面呈現(xiàn)抗原小肽的HBc融合蛋白的原核通用表達(dá)載體，借此通用載體可實(shí)現(xiàn)表面呈遞抗原小肽的HBc融合類(lèi)病毒顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)利用通用載體成功構(gòu)建表達(dá)載體pRGHBc－BS／PEP－3，并在大腸桿菌中成功表達(dá)和純化融合蛋白HBc／PEP－3。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此通用載體所表達(dá)的融合蛋白的純化條件進(jìn)行了探索，初步獲得了利用此載體進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)和純化策略，為該載體以后在基于HBc的表位抗原表達(dá)及其在疫苗等應(yīng)用研究方面奠定了基礎(chǔ)。

［1］Francis M J，Hastings G Z，Bronw A L，et al.Immunological properties of hepatitis B core antigen fusion proteins［J］.Proceedings of National Academy of Science of United States of America，1990，87：2545－9.

［2］Elisa Crisci，Juan Barcena，Maria Montoya.Virus－like particles：The new frontier of vaccines for animal viral infections［J］.Veteinary Immunology and Immunopathology，2012，148：211－225.

［3］Pumpens P，Grens E.HBV core particles as a carrier for B cell／T cell epitopes［J］.Intervirology，2001，44（2／3）：98－114.

［4］Pumpens P，Grens E.Hepatitis B core particles as a universal display model：A structure－function basis for development［J］.FFBS Letters，1999，442（1）：1－6.

［5］Dhanasooraj D，Kumar R A，Mundayoor S.Vaccine delivery system for tuberculosis based on nano－sized hepatitis B virus core protein particles［J］.International Journal of Nanomedicine，2013，8：835－843.

［6］Moscatello D K，Holgado－Madruga M，Godwin A K，et al.Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors［J］.Cancer Research，1995，55（23）：5536－5539.

［7］Heimberger A B，Hlatky R，Suki D，et al.Prognostic effect of epidermal growth factor receptor and EGFRvⅢin glioblastoma multiforme patients［J］.Clinical Cancer Research，2005，11（4）：1462－66.

［8］Bigenr S H，Humphrey P A，Wong A J，et al.Characterization of the epidermal growth factor receptor in human glioma cell lines and xenografts［J］.Cancer Research，1990，50：8017－8022.

［9］Li G，Mitra S，Wong A J.The epidermal growth factor variantⅢpeptide vaccine for treatment of malignant gliomas［J］.Neurosurgery Clinics of North America，2010，21：87－93.

［10］Moscatello D K，Ramirez G，Wong A J.A naturally

occurring mutant human epidermal growth factor receptor as a target for peptide vaccine immunotherapy of tumors［J］.Cancer Research，1997，57（8）：1419－1424.［11］Ravin N V，Kotlyarov R Y，Mardanova E S，et al.Plant－produced recombinant influenza vaccine based on virus－like HBc particles carrying an extracellular domain of M2protein［J］.Biochemistry Biokhimiia，2012，77（1）：33－40.

［12］Sun Chang，Ding Feixiang，Wang Fang，et al.Screen of multifunctional monoclonal antibodies against hepatitis B core virus－like particles［J］.Microbiology and Immunology，2009，53：340－348.

［13］Kratz P A，Bottcher B，Nassal M.Native display of complete protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids［J］.Proceedings of National Academy of Science of United States of America，1999，96（5）：1915－1920.

［14］Heimberger A B，Crotty L E，Archer G E，et al.Epidermal growth factor receptor vⅢpeptide vaccination is efficacious against established intracerebral tumors［J］. Clinical Cancer Research，2003，9 （11）：4247－4254.

［15］段小藝，王健生，郭佑民.EGFR vⅢ與HBcAg重組疫苗抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2007，23（7）：600－602.

［16］Anhua Wu，Jing Xiao，Lars Anker，et al.Identification of EGFR vⅢ－derived CTL epitopes restricted by HLA A0201for dendritic cell based immunotherapy of gliomas［J］.Journal of Neuro－oncology，2006，76（1）：23－30.

［17］Wynne S A，Crowther R A，Leslie A G.The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid［J］.Molecular Cell，1999，3：771－780.