虞建新，吳　奇，楊　歡(九江學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江西九江332000)

丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

虞建新△，吳奇，楊歡
(九江學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江西九江332000)

［摘要］目的:觀察丹參酮IIA對(duì)高糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，并探討相關(guān)的作用機(jī)制。方法:四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況;免疫印跡法檢測(cè)抗凋亡分子Bcl-2、促凋亡分子Bax以及細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:丹參酮IIA可抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的減少以及凋亡率的增加。此外，丹參酮IIA處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax蛋白表達(dá)顯著減少，并且線粒體Cyt C釋放受到明顯抑制。結(jié)論:丹參酮IIA可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)而對(duì)抗高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

［關(guān)鍵詞］丹參酮IIA;高糖;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層介于血流和血管內(nèi)側(cè)之間的縱向細(xì)胞［1］。內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整是維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定關(guān)鍵因素。已有研究表明，在如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化以及糖尿病等一系列心血管疾病當(dāng)中，均可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其功能亦受到明顯的損害［2-3］。

丹參酮IIA(tanshinone IIA，Tan IIA)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的主要有效成分之一，具有脂溶性，其可抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板聚集和擴(kuò)張冠脈血管及抗炎作用［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立高糖環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，探討丹參酮IIA對(duì)內(nèi)皮的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1材料與試劑

M199培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen;胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Tan IIA、葡萄糖、甘露醇購(gòu)自Sigma; Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)和β-actin抗體購(gòu)自CST; Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司; HRP標(biāo)記II抗、ECL發(fā)光劑購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

健康孕婦分娩后臍帶取自九江學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)房。使用適量的胰蛋白酶與37℃消化10 min，收集消化液并置于含有20%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的M199培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下生長(zhǎng)匯合。本實(shí)驗(yàn)采用3～5代狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞。

將體外分離培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、高糖處理組、溶劑對(duì)照組、藥物組。陰性對(duì)照組給予細(xì)胞35 mmol/L甘露醇作為等滲透壓對(duì)照;高糖處理組直接給予細(xì)胞35 mmol/L葡糖糖處理24 h;藥物組為35 mmol/L葡糖糖與10 μmol/L丹參酮IIA共孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h;溶劑對(duì)照組則加入與丹參酮IIA相同體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率將細(xì)胞以5× 106/L密度接種到96孔板，每組5個(gè)復(fù)孔，經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h避光加入10 μL、5 g/L MTT，混合均勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min溶解結(jié)晶體，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定吸光度(A)表示細(xì)胞的存活情況。

3.2內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)用不含EDTA的胰蛋白酶消化并收集內(nèi)皮細(xì)胞，500 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀。將細(xì)胞重懸于緩沖液中，并加入Annexin V-FITC室溫避光反應(yīng)15 min，隨后立即加入標(biāo)記緩沖液，并用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡的情況。

3.3線粒體提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體提取使用Thermo提供的Mitochondria Isolation Kit，并根據(jù)該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.4免疫印跡法檢測(cè)凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，使用細(xì)胞裂解液收集并離心提取上清蛋白或者使用試劑盒提取線粒體。以考馬斯亮藍(lán)法對(duì)總蛋白或者線粒體蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，隨后于100℃水浴中變性5 min，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，卸下分離膠覆上硝酸纖維膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)，封閉液封閉后，孵育相應(yīng)抗體過(guò)夜，繼而室溫孵育對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記II抗1 h，用ECL試劑盒顯影并用X片感光沖洗，膠片用凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果采用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用單因素方差分析(oneway ANOVA)比較組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1丹參酮IIA對(duì)高糖抑制內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

用MMT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組對(duì)細(xì)胞存活率并沒(méi)有明顯影響，而高糖處理組中細(xì)胞的存活率明顯降低(P＜0.05) ;與高糖處理組相比，藥物組中細(xì)胞存活率明顯增加(P＜0.05)，表明丹參酮IIA可抑制高糖引起內(nèi)皮細(xì)胞存活率的減少;溶劑對(duì)照組對(duì)細(xì)胞存活率并沒(méi)有干擾作用，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effects of Tan IIA on the cell viability of high glucose-induced HUVECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖1丹參酮IIA對(duì)高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

2丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示高糖處理可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而甘露醇處理對(duì)細(xì)胞凋亡率并沒(méi)有明顯影響;與高糖對(duì)照組相比，孵育了丹參酮IIA后，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯減少，見(jiàn)圖2。

3丹參酮IIA對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

抗凋亡分子Bcl-2和促凋亡分子Bax以及它們兩者的比率Bcl-2/Bax決定了細(xì)胞的生存或者凋亡的狀態(tài)。免疫印跡結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05) ;而給予丹參酮IIA處理后，高糖所引起B(yǎng)ax蛋白表達(dá)的增加和Bcl-2蛋白表達(dá)的減少均受到明顯的抑制(P＜0.05) ;空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間、溶劑對(duì)照組和藥物組之間差異均不顯著，見(jiàn)表3。

4丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體Cyt C釋放的影響

免疫印跡法結(jié)果顯示:高糖處理組線粒體中Cyt C的含量較空白對(duì)照組明顯降低，而胞漿中Cyt C的含量明顯升高(P＜0.05) ;藥物可明顯抑制線粒體中Cyt C的減少以及胞漿中Cyt C的增加。提示丹參酮IIA能夠抑制高糖誘導(dǎo)Cyt C從線粒體釋放進(jìn)入胞漿的過(guò)程，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effects of TanⅡA on the apoptosis of high glucose-induced HUVECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖2丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 3.The effects of Tan IIA on the expression of Bax and Bcl-2 in the HUVECs with or without high-glucose treatment.Mean± SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖3丹參酮IIA對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of Tan IIA on high glucose-induced Cyt C release in the HUVECs with or without high-glucose treatment.Mean ±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs high glucose.圖4丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)線粒體Cyt C釋放的影響

討論

糖尿病患者心血管疾病死亡率占糖尿病總死亡率的75%以上［5］。內(nèi)皮功能不全是糖尿病心血管病變的主要特征之一，而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡則是內(nèi)皮功能不全的始動(dòng)環(huán)節(jié)［5］。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加不僅造成了血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)層的損害，還嚴(yán)重地?fù)p害了血管的正常功能，如抑制血管的舒張功能，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，削弱血管張力等，最終導(dǎo)致血管病變的發(fā)生［6］。因此，如何有效對(duì)抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，維持血管內(nèi)皮層穩(wěn)態(tài)對(duì)防治糖尿病心血管并發(fā)癥具有重要的意義。中草藥丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛和寧心安神的功效［8］，臨床上廣泛用于多種缺血性疾病的治療。其中丹參酮IIA是丹參脂溶性的有效成分，具有抑制血小板聚集、清除氧自由基、抑制炎癥反應(yīng)，抗腫瘤活性以及改善微循環(huán)等作用［2］。例如，Li等［4］研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA在糖尿病大鼠中可改善高糖所引起的內(nèi)皮舒張功能障礙，可能與其上調(diào)eNOS的表達(dá)相關(guān)。此外，丹參酮IIA能抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的活性［9］。以上研究表明丹參酮IIA在維持內(nèi)皮功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著十分重要的作用，然而丹參酮IIA對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制目前尚不十分清楚。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞的存活率顯著降低，而丹參酮IIA可逆轉(zhuǎn)此作用，提示丹參酮IIA可抑制高糖處理后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率。再者，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)了丹參酮IIA顯著降低高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。此外，本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)丹參酮IIA作用于高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞后以線粒體途徑凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中抗凋亡分子Bcl-2和促凋亡分子Bax決定了細(xì)胞生存或者凋亡的狀態(tài)，是細(xì)胞凋亡內(nèi)源性線粒體通路的重要調(diào)節(jié)因子［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹參酮IIA的處理使Bcl-2的表達(dá)增加同時(shí)Bax的表達(dá)減少，從而增加Bcl-2/Bax比值，使得線粒體膜電位升高，抑制Cyt C從線粒體釋放進(jìn)入胞漿中。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明丹參酮IIA能夠?qū)垢咛钦T導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制線粒體Cyt C釋放有關(guān)。該研究為治療糖尿病內(nèi)皮功能紊亂提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及思路。

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(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

Tanshinone IIA prevents high glucose-induced human umbilical vein endothelial cell apoptosis

YU Jian-xin，WU Qi，YANG Huan
(Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Jiujiang University，Jiujiang 332000，China.E-mail: yjx904322@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of tanshinone IIA on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) after high glucose treatment.METHODS: The cell viability was determined by MTT assay.The cell apoptotic rate was examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.The expression of Bcl-2 and Bax，and the release of mitochondrial cytochrome C (Cyt C) were analyzed by Western blotting.RESULTS: Tanshinone IIA significantly inhibited high glucose-induced decrease in cell viability and increased the cell apoptosis.Additionally，after tanshinone IIA treatment，Bax expression and the release of mitochondrial Cyt C were significantly inhibited，while Bcl-2 expression was increased.CONCLUSION: Tanshinone IIA prevents high glucose-induced endothelial cell apoptosis via mitochondria-dependent pathway.

［KEY WORDS］Tanshinone IIA; High glucose; Endothelial cells; Apoptosis

通訊作者△Tel: 022-84683114; E-mail: yjx904322@163.com

［收稿日期］2015-04-28［修回日期］2015-05-26

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1720-04

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.034